Angew | 设计用于调节活细胞中 DNA G-四链体的偶氮苯光控开关

大家好，今天为大家分享的文献是2024年9月发表在Angew. Chem. Int. Ed.的A Rationally Designed Azobenzene Photoswitch for DNA GQuadruplex Regulation in Live Cells。本文的通讯作者是来弗罗茨瓦夫大学的Marco Deiana博士，他的主要研究方向是非经典DNA结构作为靶点的癌症治疗。

研究背景

G-四链体（G4s）是一种非经典的DNA二级结构，研究表明G4的形成序列大量存在于癌基因中。G4s在调控DNA复制、转录、端粒维持和其它生物过程中具有重要功能，因此被认为是癌症治疗中有潜力的新颖性生物靶标。G4s对活性氧十分敏感，可做为光动力疗法的靶标，而将光响应基团整合到G4结合配体的结构中可以实现对G4的调控。但对光响应配体的研究存在局限性，例如需要紫外光（≤365 nm）来激发配体的活性形式且该过程不可逆。结合了邻位氟原子功能化的偶氮苯（AB）分子开关提供了解决上述问题的途径，但目前与此相关的研究仅限于体外，其在生物系统中的应用潜力尚未被证明。本研究开发了一种可以利用可见光进行定量的双向异构化的邻位氟化偶氮苯开关Q-Azo4F-C，并成功地将其应用于活细胞中G4s的调节。

研究结果

首先，作者合成了化合物Q-Azo4F-C，其由可以稳定G4结构的喹啉单元和可以使G4失稳或展开的正电荷的酰胺侧链两部分组成（图1A）。作者使用紫外-可见光谱(图1B）和¹⁹F NMR光谱（图1C）对化合物顺反异构体进行的定性和定量的表征。根据的定量测定，在绿光（λ≥550nm）照射下，该过程产生的光稳定态（photostationary state, PSS）中包括93%的顺式异构体，而在蓝光（436 nm）照射下PSS中包括91%的反式异构体。值得注意的是，顺式Q-Azo4F-C具有很高的热稳定性（图1D）。

图1 Q-Azo4F-C的结构和表征

随后，作者利用荧光猝灭实验对Q-Azo4-C和G4s的结合亲和力进行定量（图2A）。反式的结合常数大于顺式的结合常数，证明反式配体与G4s具有更强的亲和力。为了更全面地了解Q-Azo4F-C与G4s之间相互作用的结构基础，作者使用c-MYC Pu22 G4进行了¹H NMR实验。在trans-Q-Azo4F-C的滴定过程中，观察到亚氨基信号的逐渐增宽，作者推测反式配体可能会导致G4s结构的展开（图2B）。而在cis-rich -Q-Azo4F-C的滴定过程中，亚氨基信号变化较小，作者推测顺式顺式配体对G4结构的扰动较小（图2C）。接着，作者使用可见光引发的配体的顺反异构化，核磁结果表明，可见光诱导的Q-Azo4-C的构象转变具有一定的可逆性（图2D）。

图2 Q-Azo4F-C与G4s之间的相互作用

为了进一步探索Q-Azo4F-C与c-MYC Pu22的结合模式并计算其相互作用自由能，作者进行了分子对接和经典分子动力学（MD）模拟（图3A-B）。通过比较每个异构体的最稳定构型的自由能，发现反式状态的相互作用( 106.6 kcal/mol )强于顺式状态的分子( 94.8 kcal/mol )，再次证明反式配体与G4s的结合更强。作者通过逐核能量分解（图3C-D）分析得出结论，顺式配体倾向于从外部结合G4s，而反式配体倾向于从内部插入结合G4s。

图3 顺式和反式配体与G4s结合模式的结构模拟

作者进行了基于CD的熔融试验，熔解温度（+ΔT_m）表明，与反式相比，在富含顺式混合物Q-Azo4F-C的存在下，G4的稳定程度更高，并且这两种异构体对双链熔化温度的几乎没有影响（图4A）。为了排除双链DNA对配体与G4配位模式的潜在干扰，作者使用c-MYC Pu22作为G4模型进行了¹H NMR竞争结合实验。核磁图中亚氨基质子的化学位移扰动不受双链DNA的影响，证实了配体对G4结构具有更高的亲和力，也证明了即使存在双链DNA，顺反异构体也能精确地引发G4的构象变化（图4B）。复杂的细胞内环境中含有各种金属离子，可促进G4结构的构象变化，从而可能影响或阻碍配体的结合。为了解决这个问题，作者研究了细胞内富含的离子对Q-Azo4F-C与G4s结合的影响（图4C-D），如图所示，离子的存在并未导致配体与c-MYC Pu22的配位模式发生显著变化。这些发现进一步支持了Q-Azo4F-C在活细胞内进行实验的潜力。

图4 双链和离子对配体结合的影响

随后，作者探索了通过开关状态的相互转换来调节配体的细胞毒性（图5）。作者使用了四种不同的人类肿瘤细胞系，包括宫颈癌HeLa细胞、骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌MCF-7细胞和肺腺癌A549细胞。在反式配体表现出温和的细胞毒性作用，顺式配体显示出较强的细胞毒性。研究结果表明，反式IC₅₀/顺式富集PSS IC₅₀的比值高（11至>25），这表明Q-Azo4F-C具有通过可见光调节其细胞毒性的潜力。为了验证这一假设，作者将细胞暴露在富含顺式PSS的Q-Azo4F-C的细胞毒性水平下1小时。随后，将细胞暴露在波长为436纳米的蓝光下10分钟，以诱导顺反异构。实验结果表明配体的细胞毒性下降，细胞活性与直接顺式配体处理的细胞相比有了较大提升。

图5 Q-Azo4F-C对不同肿瘤细胞活性的影响

作者检测了反式和顺式异构体表现出的光依赖性细胞毒性是否与其在细胞内折叠G4s的能力相关（图6)，选择A549细胞作为模型系统，为了可视化和定量测定A549细胞中的G4水平，使用了广泛表征的G4特异性抗体BG4。如图所示，与mock处理的细胞相比，反式配体处理的细胞显示G4 foci的数量减少，表明细胞内G4s处于展开状态；顺式配体处理的细胞显示G4 foci的数量增加，表明配体促进了细胞内G4s的温度。同时，配体处理的效果呈现出明显的浓度依赖性。