PNAS | 氨基酸通过调节蛋白-蛋白相互作用影响其相分离行为

今天分享的是2024年12月发表在Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.上的一篇文章，标题为Amino acids modulate liquid–liquid phase separation in vitro and in vivo by regulating protein–protein interactions.

有关作者：

本文的通讯作者是来自洛桑联邦理工学院的Francesco Stellacci教授，其研究方向为纳米材料、超分子相互作用和固体-液体界面科学等。

研究背景：

由蛋白和/或核酸通过液-液相分离（Liquid–liquid phase separation, LLPS）形成的生物分子凝聚物对于细胞的稳态有重要作用，也与多种疾病的发生相关，因此成为近十年的研究热点。对于LLPS过程的研究多在体外进行，然而活细胞内的LLPS较体外存在较大差异。磷脂和ATP等生物分子被报道影响细胞内的LLPS，但其对体外LLPS过程的影响鲜有研究。

除磷脂和ATP之外，氨基酸也是一种主要的细胞内生物分子。在哺乳动物细胞中，游离氨基酸所占的体积超过25%。在正常条件下哺乳动物细胞质中氨基酸的浓度约50 mM，且在压力条件下其浓度增加到几百mM。此前研究报道氨基酸可作为渗透剂稳定蛋白的构象，从而抑制其变性和聚集。Stellacci课题组之前的工作报道氨基酸可以稳定蛋白分散物。本文作为该工作的后续，探索氨基酸对蛋白-蛋白相互作用和LLPS的影响。

实验结果：

本文的研究分为体外和细胞内两部分。对于体外研究，作者选取BSA作为折叠蛋白的模型，而FUS₂₆₇则作为内在无序蛋白的模型。作者利用沉降-扩散平衡分析型超速离心(Sedimentation-diffusion equilibrium analytical ultracentrifuge，图1A)测定蛋白在不同脯氨酸浓度下的第二维里系数（the second virial coefficient,B₂₂），∆B₂₂>0表示蛋白之间的排斥性作用力增加、蛋白溶液更加稳定，而∆B₂₂<0则表示蛋白之间的吸引增加、蛋白溶液更加不稳定。对于BSA，脯氨酸浓度的增加导致∆B₂₂的增加（图1B），且由B₂₂推导出的BSA直径与其流体动力学直径相符，说明此时BSA溶液更加稳定。作者随即研究脯氨酸对BSA相分离的影响：在加入PEG引发相分离之后，作者通过离心分离出富含BSA的液滴相和BSA浓度较低的稀相（图1C），再通过紫外-可见光谱测定稀相中的BSA浓度。作者发现脯氨酸的存在提高了BSA在稀相中的浓度（图1D），说明BSA溶液变得稳定。作者用同样的方法研究了脯氨酸对FUS₂₆₇的影响，发现脯氨酸的加入使得∆B₂₂增加（图1E）、FUS₂₆₇稀相浓度增加（图1F）且FUS₂₆₇液滴尺寸变小（图1G），说明FUS₂₆₇溶液也变得更加稳定。

图1.脯氨酸对BSA和FUS₂₆₇的蛋白-蛋白相互作用和LLPS的影响。

在体外实验建立脯氨酸对蛋白质LLPS的影响后，作者以应激颗粒（stress granule，由蛋白质和RNA通过相分离形成的生物凝聚物）为模型探究氨基酸对于细胞内LLPS的影响。作者首先通过加入亚砷酸钠引发U2OS细胞的氧化应激，45分钟后在阳性对照中观察到应激颗粒的形成（图2A）。在用200mM脯氨酸对细胞预处理两小时的实验组中，应激颗粒的数量相较于阳性对照组减少（图2A-B）。除脯氨酸外，谷氨酰胺和甘氨酸的加入也可显著降低U2OS细胞内的应激颗粒数量（图2C）。此外，脯氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸也可以降低由热休克（heat shock）引起的应激颗粒的数量（图2A、2D）。作者在Hela细胞中也观察到相似的现象（图2E-G）。

图2.脯氨酸及其他氨基酸对U2OS和Hela细胞中应激颗粒的影响。

为了建立本文研究对象与疾病干预之间的联系，作者研究了氨基酸对原代人真皮成纤维细胞（primary human dermal fibroblast cells）中LLPS的影响，因为原代成纤维细胞常被用作应激颗粒相关神经退行性疾病的细胞模型。在亚砷酸钠处理2小时后，阳性对照组中出现了大量应激颗粒（图3A-B），而用脯氨酸、谷氨酰胺或者甘氨酸处理的实验组中，应激颗粒的数量显著减少（图3C-F）。

图3.脯氨酸及其他氨基酸对原代成纤维细胞中应激颗粒的影响。

接着，作者利用组成性表达（constitutively expressing）GFP标记的G3BP1的U2OS细胞研究氨基酸对应激颗粒形成动态的影响。在阳性对照组中，应激颗粒在15分钟后开始形成，在25分钟达到饱和，随即开始融合（图4A-C）。相反地，在加入亚砷酸钠之前、同时或者之后用脯氨酸处理细胞，均导致应激颗粒形成速率降低、饱和数量降低（图4A-B）。用谷氨酰胺处理U2OS细胞也得到类似的结果（图4C）。

图4.脯氨酸及谷氨酰胺对U2OS细胞中应激颗粒过程的影响。

最后，为理解氨基酸抑制应激颗粒形成的原理，作者探究了脯氨酸对G3BP-G3BP（应激颗粒中的支架蛋白）和ssDNA-ssDNA（作为被招募至应激颗粒中的RNA的模型）相互作用的影响。G3BP-G3BP相互作用和ssDNA-ssDNA相互作用的B₂₂均随着脯氨酸浓度的升高而增加，表明脯氨酸的存在削弱了G3BP-G3BP和ssDNA-ssDNA各自的吸引力（图5A-B）。基于上述实验现象，作者提出，氨基酸通过削弱应激颗粒组分之间的相互作用抑制应激颗粒的形成（图5C）。