Clinical Chemistry | 人类尿液转录组和代谢组的去卷积分析

大家好，今天为大家分享的文献是2024年11月发表于Clinical Chemistry上的Deconvolution of Human Urine across the Transcriptome and Metabolome。

背景图

作者介绍

本文的通讯作者为斯坦福大学的Stephen R. Quake教授。Stephen R. Quake教授团队致力于开发新的生物测量方法，并将这些方法应用于基础科学和医学领域的相关问题，研究兴趣包括基因组诊断、系统生物学、微生物生态学以及单细胞基因组学，研究方向主要为单细胞测序、免疫库测序、细胞外游离核酸测序等。

研究背景

许多泌尿生殖系统疾病都涉及特定细胞类型的病理生理变化，其金标准诊断常常需要侵入性活检，例如慢性肾病的明确诊断往往需要超声引导下肾脏穿刺，前列腺癌亦需经直肠穿刺。这些操作对患者而言并非无风险，且目前的金标准筛查工具对于疾病早期检测的能力仍然有限。

细胞外游离RNA（cell-free RNA, cfRNA）液体活检通过检测血液中的细胞外RNA，可以反映组织或细胞类型特异性的基因动态变化，为广泛的生理变化和疾病的早期诊断监测提供了研究前景。然而，由于泌尿生殖系统相关的细胞类型在基于血液的cfRNA检测中丰度较低，限制了血液cfRNA检测捕获疾病早期变化的敏感性。

尿液中既含有细胞来源的核酸，也含有细胞外游离核酸，它们直接与泌尿生殖系统组织接触；同时，尿液中含有多种代谢产物，包括细胞代谢的副产物，因此被认为是一种可反映泌尿系统细胞类型特异性信号的体液。然而，现有的对于尿液核酸的研究多集中于小RNA，尚不能全面确定其来源的细胞类型。此外，尿液溶质浓度的变化、细菌生长等现实问题也影响了尿液细胞外转录组学（cf-transcriptome）的应用，因此目前的研究主要局限于针对尿液沉淀物的分析。

本研究将针对以上的未满足需求，对尿液中cfRNA和沉淀物RNA的转录组，以及尿液代谢组进行测量与分析，并将其结果与血浆cfRNA组学数据进行对比。

研究结果

图1 尿液沉淀物转录组和细胞外游离核酸转录组的来源细胞类型

研究者们从18名患者（12名肾结石患者vs 6名健康对照者）的尿液标本中分离并对尿液沉淀物RNA和细胞外（上清液）游离RNA进行测序（图1A）。在健康男性对照者的尿液沉淀物RNA中，研究者们观察到来自肾脏上皮和前列腺上皮的大量细胞类型特异性RNA，此外还有角质形成细胞和免疫细胞，以及膀胱尿路上皮细胞和施旺细胞（图1B）。此外，研究者们还观察到来自非泌尿生殖系统细胞类型的少量RNA分布，包括肝内胆管细胞、周细胞、呼吸道相关细胞和肠道细胞等等。

研究者们注意到肠道细胞特异性RNA在相对分数贡献上的差异。因此，他们进一步探讨了肠道细胞类型标志基因ANPEP和MUC2的表达水平。ANPEP编码丙氨酰氨肽酶，这种酶在小肠中促进肽的分解，在肾小管绒毛中有一定程度的表达，但其在肠道中的表达水平最高。MUC2编码一种分泌性黏蛋白，是胃肠道黏液的主要成分，其表达仅限于肠道。研究者们观察到尿沉渣RNA中的这两个标志基因的表达水平相对于尿cfRNA中显著升高（图1C）。

随后，研究者们独立评估了两种尿液转录组中泌尿生殖系统细胞类型特异性信号的相对丰度。通过特征评分分析，研究者们观察到尿液cfRNA中前列腺腔面上皮细胞特征分数显著高于尿沉渣RNA，但在膀胱尿路上皮细胞和近端小管细胞特征评分中未见显著差异，提示这两种尿液组分均适合用于这些细胞类型的检测（图1D）。

接下来，研究者们探讨了是否能够通过尿液解析膀胱癌的细胞病理生理学特征。膀胱尿路上皮细胞是膀胱癌的主要起源细胞类型，其异常增殖会发展为肿瘤。研究者们定义了相关的细胞类型特异性基因谱，并将其应用于已发表的膀胱癌患者尿沉渣RNA数据，发现膀胱癌患者膀胱尿路上皮细胞的特征评分升高（图1E），这一发现提示尿液转录组测量具有反映泌尿生殖组织中细胞类型特异性变化的潜力。

图2 火山图显示尿液转录组与血浆cfRNA转录组中细胞类型特异性RNA去卷积比例的差异

尿液和血液与不同的组织相互作用，因此可能反映不同的细胞类型特异性信号。因此，研究者们比较了尿液cfRNA和尿液沉渣转录组与血浆cfRNA转录组的细胞类型谱差异（图2）。在血浆cfRNA中，研究者们观察到来源于造血细胞的细胞类型特异性RNA比例相对较高。而在两种尿液转录组中，研究者们观察到泌尿生殖系统细胞类型特异性RNA的富集，包括前列腺上皮细胞、肾脏上皮细胞，以及尿液cfRNA中可见的分泌细胞和纤毛细胞。此外，研究者们还观察到非泌尿生殖系统来源的细胞类型特异性RNA，如肠道细胞相关RNA在两种尿液组分中均有富集，而血管内皮细胞相关RNA在血浆cfRNA中富集。这些结果强调了尿液转录组相对于血浆cfRNA转录组的细胞类型分布特征的差异。

图3 尿液细胞外和沉淀物转录组中的细胞类型谱与血浆细胞外转录组中的细胞类型谱不同

一些非泌尿生殖系统的细胞类型在尿液转录组中相对于血浆cfRNA显著富集，这可能反映了尿液转录组学应用过程中面临的挑战。在尿沉渣RNA中，角质形成细胞相关RNA的富集程度较高，且其相对分数贡献具有较大变异性（图3A）。这与临床观察一致：这些细胞是传统尿液细胞学中污染来源之一。在部分肾结石患者中，尿液试纸检测显示白细胞酯酶阳性，提示有炎症发生，而在这些尿液样本中，研究者们观察到其尿沉渣转录组中的中性粒细胞特异性RNA占比较高（图3A）。这些结果表明，与尿沉渣RNA相比，尿液cfRNA在非侵入性检测泌尿生殖系统细胞类型和组织时结果更加稳定，尤其是在伴有炎症的患者中。这也提示了根据目标疾病和组织，采用不同的尿液组分分析具有更大的临床价值。

研究者们还发现，与血浆cfRNA相比，尿液中去卷积的细胞类型谱表现出更高的样本间异质性（图3B）。这种变异性很可能与尿液溶质浓度的变化一致，例如患者的饮水量和排尿量等因素都有可能对其影响。研究者们采用了一种特殊的RNA文库标准化方法，测量了尿液肌酐浓度以及尿液体积，并将其作为差异表达分析中的协变量，以应对溶质浓度的变化带来的测序差异，而后再对两种尿液组分相对于血浆的差异基因进行交叉分析，再次观察到膀胱尿路上皮细胞、近端小管细胞以及尿液cfRNA中的前列腺腔面上皮细胞的相关RNA信号显著富集。综上所述，相对于血浆cfRNA，研究者们在尿液转录组中可持续观察到这些细胞类型信号的升高，突出了尿液转录组的优势，即可以富集来自血浆cfRNA中低丰度、难以活检到的相关信号。此外，对这些差异基因进行通路富集分析，发现其在代谢活性相关通路中显著富集（图3C），进一步突出了尿液相对于血浆独特的转录组学特征。

图4 尿液转录组和代谢组的通路与细胞类型层级整合

接着，研究者们结合尿液RNA测序结果，同时考察了尿液的代谢组学数据（图4A）。研究者们观察到氨基酸及其衍生物、核酸、碳水化合物、脂肪酸及其结合物、肉碱和外源化合物占主导地位，这与之前对人类尿液代谢组学谱的特征描述一致。将尿沉淀RNA与尿cfRNA中共同富集的通路（KEGG）与代谢组学数据比较后发现，除了草酰乙酸、二羧酸代谢以及β-丙氨酸代谢外，不同氨基酸代谢通路也表现出共同富集，证明了能够通过尿液转录组学非侵入性地测量在相同通路中富集的基因和代谢物（图4B）。

在尿液中共同测量比较了富集于相同通路的代谢物和转录本后，研究者们进一步探讨了与近端小管这一高代谢性肾脏细胞类型重叠的代谢子系统。将来自近端小管细胞类型基因谱和人类代谢图谱中的代谢组学数据进行交集分析，发现了其在尿液转录组和代谢组中的高代谢活性（图4C）。

研究总结

由于尿液与血液接触的组织不同，且包含其特有的代谢产物，因此通过检测人类尿液的转录组可能可以提供一种了解尿液来源细胞类型的非侵入性手段。本研究是最早对同一个体体液中的cfRNA和代谢组同时进行测量并比对的研究之一，同时其采用了一种特殊的RNA文库标准化方法，测量了尿液肌酐浓度以及尿液体积，并将其作为差异表达分析中的协变量，以应对溶质浓度的变化带来的测序差异。此外，研究者也猜测尿液cfRNA中来自于泌尿生殖道以外的实质器官细胞类型信号富集可能是血液中RNA被肾小球过滤后进入尿液的结果，这些器官的细胞更新速率在体内处于较高水平。