Science Advances丨用于同时检测多种疾病的紧凑型高灵敏度光热逆转录环介导等温扩增芯片

大家好，今天分享的文献是2024年11月发表在Science Advances上的“Compact highly sensitive photothermal RT-LAMP chip for simultaneous multidisease detection”。

作者介绍

本篇文章有三位通讯作者，分别是来自哈尔滨工业大学机电工程学院的任玉坤教授与陶冶副教授以及来自哈尔滨医科大学附属第一医院的周海舟教授。任玉坤教授的研究方向是非线性电场调控微纳流体与颗粒、肿瘤早期检测系统、阻抗传感与生物医学检测等，陶冶副教授的研究方向是单细胞测序与数字PCR生物检测、液体活检及肿瘤早期诊断系统开发、微流控技术的高通量检测分选装备系统研究。周海舟教授的研究方向是传染性病原体、自身免疫性疾病等检测。

背景介绍

在资源有限的环境中进行早期、快速和精确的疾病诊断对于遏制病毒传播和提高治疗效果至关重要。2019年新冠疫情诊断系统检测时间较长，且过度依赖专业设施和人员，尤其是在缺乏成熟医疗基础设施的地区中这一局限性尤为显著。因此，开发一个操作简单、检测快速、成本可控以及高灵敏度和高特异性的即时检测平台至关重要。但是目前在疾病检测方面仍然缺乏一种全面的诊断解决方案。侧向层析免疫测定虽然提供了快速且经济的检测，但在敏感性和特异性方面通常受限。而PCR往往需要大量的分析设备和熟练的操作人员。作为一种核酸扩增的新方法，LAMP则凭借强大的耐受性、不依赖于昂贵仪器设备的特点以及更短的检测时间脱颖而出。然而，核酸扩增通常在热循环仪中进行的，由于其功耗高，因此将LAMP集成到POCT设备具有一定挑战性。在此背景下，光热系统应运而生。它可以通过电子的相干振荡产生热量从而实现快速光热加热。其中，金薄膜在与LED耦合时呈现了简单的制备过程和快速的光热转换，使其成为POCT应用的便捷选择。此外，“样本进、结果出”的POCT发展中的另一个巨大挑战是多重检测。因此，同时检测样本中的多个致病靶点也至关重要。

结果介绍

1.高灵敏度光热逆转录环介导等温扩增（SPRC）芯片制备

首先，研究团队利用光学、化学、生物学和热力学原理开发了SPRC芯片。其导流层用于将溶液从加载槽均匀分布到每个反应室，从而实现多路检测。过滤层则由两种不同类型的滤纸和石蜡颗粒组成，主要用于过滤溶液中的杂质和捕获核酸。手动旋转加载槽即可将富含核酸的滤纸直接移动到各自的反应室上方，再通过底部加热进行片上洗脱和扩增。每个反应室可单独加热，不仅提高了加热效率也避免了资源浪费。当光子照射Au膜表面时，可激发局部表面等离子体共振，同时将膜表面电子提升到高能状态，从而产生热电子，最终实现均匀的热分布。具体而言，首先在上样时实现核酸的预富集，然后在芯片上进行核酸洗脱和LAMP，最后通过荧光即可检测扩增产物。

为了提高SPRC的可操作性，研究人员还开发了一种紧凑型设备，只需要将裂解的样本转移到加载槽便可以自动提取、扩增和检测核酸。与传统LAMP相比，SPRC可以实现约350倍的预浓缩，即使对于低浓度的样本，也可以在30分钟内获得准确的检测结果。

2．光热效应与滤纸性能

其次，研究发现当入射光的波长为465 nm时，10 nm厚的Au薄膜能传输大量的电磁能，且随着薄膜厚度的增加，越来越多的入射光被吸收。当Au薄膜尺寸为厚度120 nm，L=8 mm和S=20 μm时光热转换效果最好。为了更好地促进核酸的吸附，研究团队采用了双层滤纸方案。上层使用PES膜过滤样品中的杂质，同时控制流速。下层在Fusion5表面修饰壳聚糖低聚糖，用于吸附核酸。随着样品中DNA含量的增加，滤纸上捕获的DNA逐渐趋于饱和，针对8 ng样品起始量仍保持70%以上的捕获效率。而且改良的Fusion5滤纸可以在1 nm浓度下捕获多达1 mL的核酸，这足以用于检测各种临床样本。

3.SPRC芯片的洗脱与性能检测

再者，研究发现样品的流速随PES膜孔径的增加而逐渐增加，显著影响DNA捕获效率。由于壳寡糖只能在酸性条件下吸附核酸，这会抑制LAMP反应，因此需要在核酸吸附后用去离子水冲洗。而且与流速相比，冲洗体积对DNA捕获效率的影响更大。考虑不同孔径下的流速和DNA捕获效率，研究团队选择了3 μm的PES膜进行上层过滤。为了实现多重检测，研究人员评估了流入每个反应室的样本溶液的均匀性，发现流向四个吸水片的溶液体积基本一致，60s内的偏差保持在10%以内，从而确保每张滤纸吸附相同数量的核酸，有利于多重检测。在各种条件下，λ DNA（48,000bp）的SPRC LOD为0.2拷贝/μL，乙肝DNA（3200 bp）和丙肝RNA（9600 bp）的SPRC LOD为0.46拷贝/μL。

4.SPRC芯片的加热和保存验证

在此基础上，研究团队制造了压花镀金玻璃。在3W光源的照射下，Au薄膜的表面可以在20s内便加热到65°C。为了最大限度地减少温差对扩增结果的影响，研究团队增加了圆柱形腔室的底部面积，同时降低了其高度。每个腔室的底部直径为4 mm，高度为1.7 mm，可容纳21 μl的反应体积。而且在加热过程中腔室内的温度分布是均匀的。随着输入电压的增加，Au薄膜表面的整体温度波动逐渐减小。考虑到自加热和温度波动，研究团队选择了2V的输入电压来测量Au薄膜的电阻。该传感器具有良好的线性度，便于集成温度测量。此外，使用微控制器通过比例积分微分来控制镀金玻璃上的温度，从而确保每个腔室之间出色的加热均匀性。在长达4周的时间里，SPRC的性能没有明显变化。

根据其工作原理，该紧凑型设备可以分为三部分：电源模块、LED光热模块和太阳光聚焦光热模块。采用微控制器进行温度控制和荧光检测、再通过人机界面进行调整，每个腔室的检测结果便可显示在屏幕上。此外，该设备不需要外部电源或电池，仅依靠阳光便可实现加热和检测，适用于快速现场测试。

5.多靶点临床血清检测

为了评估SPRC的临床适用性，研究团队对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型流感病毒和艾滋病毒进行了检测。每个样本分别使用SPRC或台式PCR系统，以及相同的试剂和引物进行检测。在检测的80个样本中，SPRC成功检测了76个。而在准确检测的样本中，阳性样本的荧光强度明显高于阴性样本。除HIV外，所有疾病的ROC曲线下面积均为1。将SPRC结果与哈尔滨医科大学第一附属医院医用PCR检测系统进行比较，发现使用人工离心装置和光热芯片可以完全取代复杂的仪器进行样本处理，而且不影响检测结果。

6.鼻咽拭子和太阳能驱动临床试验

研究团队收集了20名腺病毒患者和20名COVID-19患者的鼻咽拭子，并使用额外的过滤器对样本进行预过滤，以去除较大的颗粒杂质。对于腺病毒，20个阳性样本和20个阴性样本均能通过SPRC检测得到，所有阳性样本的荧光强度均显著高于其他样本。对于SARS-CoV-2，SPRC可靠地检测到20例COVID-19患者中的18例，确定了N、E和O基因。ROC曲线显示SPRC的特异性为97.5%，表明SPRC可用于鼻咽拭子检测，证明了SPRC处理多种类型样本的能力。