课题组工作丨JACS丨亨廷顿舞蹈症中小CAG重复序列RNA相分离及其结构基础

生物大分子的相分离参与细胞的多项过程，而异常的相分离则会导致蛋白质和RNA的错误聚集，与多种癌症和神经退行性疾病的发生发展密切相关^[1-2]。在过去十多年间，研究多关注蛋白质的相分离原理及其生物学意义，而RNA的相变行为在近几年才受到关注，目前仍缺乏对RNA相分离原理和生物功能的探索^[3-4]。

亨廷顿舞蹈症（Huntington’s Disease, HD）是一种神经退行性疾病，被收录于我国2018年发表的《第一批罕见病目录》中。 该疾病是由HTT基因中 CAG三核苷酸重复序列扩增引起，其转录产生的CAG重复序列RNA具有毒性获得功能。长期以来，研究者们普遍关注冗长CAG重复序列RNA（expanded CAG repeats, eCAG RNA）的致病功能。2017，Jain和Vale发现了eCAG RNA（当重复数目≥20时）在体外和细胞内的相分离现象^[5]，近年来关于eCAG RNA相分离原理的研究表明eCAG RNA的相分离行为由冗长序列中的多价相互作用介导，因此具有长度依赖性^[5]。另一方面，小CAG重复序列RNA（small CAG repeat, sCAG RNA）是eCAG RNA被Dicer切割的产物，其长度约18-24碱基，通过RNA干扰（RNA interference）机制致病^[6]。目前，包括sCAG RNA在内的短RNA的相分离行为鲜有探索。

中国科学院杭州医学研究所韩达研究员/郭沛副研究员/陈广勇研究员团队报道了sCAG RNA在体外和细胞内的相变行为，并通过液体核磁共振波谱和先进的粗粒化分子动力学模拟等多种生物物理技术，揭示了sCAG RNA通过形成带有粘性末端的特殊双链结构介导相分离的机理，强调了RNA结构在相分离过程中的重要性。该工作以Small CAG Repeat RNA Forms a Duplex Structure with Sticky Ends That Promote RNA Condensation为题发表在J. Am. Chem. Soc.上。

在本工作中，我们首先探索了HD中致病性的sCAG RNA在体外的相变行为。如图1a-c所示，G(CAG)₇C RNA能够在含有镁离子的缓冲液中经退火后形成粒径为2至10微米的凝聚物，该相分离行为受到RNA和镁离子浓度的调控。用反义寡核苷酸链或者高浓度的氯化钠处理后，凝聚物消失，表明碱基互补配对和静电作用对该凝聚物的形成有重要作用（图1d）。在荧光漂白恢复实验中，该凝聚物的荧光恢复率约24%，表明凝聚物内部的RNA流动性较低，使得凝聚物呈现出类似凝胶的状态（图1e）。除G(CAG)₇C RNA外，更短G(CAG)₆C、G(CAG)₅C、 G(CAG)₄C也可以形成微米尺度的凝聚物（图1f），且拥挤试剂如PEG的加入可降低上述RNA相分离所需要的RNA浓度（图1g）。以上实验结果显示，含有4至7个CAG重复单元的sCAG RNA可形成与含有超过20个重复单元的eCAG RNA类似的凝聚物。我们猜测除了多价作用外，可能存在其他的关键因素调控sCAG RNA的相变行为。

图1. sCAG RNA在镁离子溶液中形成凝聚物

我们随后利用液体核磁共振波谱解析了sCAG RNA的溶液结构。在镁离子溶液中，G(CAG)_4-7C RNA形成二聚体（图2a）。以G(CAG)₄C RNA为例，液体核磁共振波谱实验结合约束型分子动力学模拟（restrained molecular dynamic simulations, rMD）表明其形成带有两个3′-AGC粘性末端的双链结构（图2b），其核磁特征信号包括螺旋区域相邻核苷酸之间的H6/H8−H1′ NOEs（图2c）、Watson-Crick碱基对之间G H1-C H41/H42 NOEs（图2d），以及粘性末端A12与螺旋区G1之间的NOE（图2e）。值得一提的是，该结构是sCAG RNA纯重复序列的首个高分辨率三维结构（PDB ID: 9KAD）。此外，我们证明了G(CAG)₇C RNA在镁离子溶液中也形成含有3′-AGC粘性末端的双链结构。

图2. sCAG RNA在镁离子溶液中形成带有3′-AGC粘性末端的双链结构。

基于上述RNA结构研究以及前人的理论框架^[7]，我们以G(CAG)₇C RNA为例，探究驱动sCAG RNA相分离的结构因素。G(CAG)₇C RNA可被拆解为由腺嘌呤形成的spacers和由鸟嘌呤-胞嘧啶形成的stickers，其中位于螺旋区的7个stickers参与碱基配对，而位于粘性末端上的stickers则保有与其他stickers相互作用的可能性（图3a）。当G(CAG)₇C RNA粘性末端的stickers被突变或者删去，RNA在退火后无法形成凝聚物；而当G(CAG)₇C RNA被进一步缩短为G(CAG)₆C RNA，RNA再次形成含有粘性末端stickers的双链结构，此时退火后能观察到凝聚物（图3b）。上述实验表明，粘性末端上的stickers对sCAG RNA凝聚物的形成至关重要。考虑到RNA自身具有加热发生相分离的倾向性，我们推测粘性末端上的stickers能介导凝聚物中交联分子网络的形成，从而在降温后捕获凝聚物（图3c）。

图3. sCAG RNA粘性末端上的stickers对凝聚物的形成至关重要

为了在核苷酸层面理解粘性末端上stickers促进凝聚物形成的原理，我们对G(CAG)₇C RNA相变的过程进行了粗粒化分子动力学模拟（coarse-grained molecular dynamic simulations, GC-MD）。在重现了体外实验中RNA浓度依赖的相分离行为（图4a）后，我们监测了100 μM G(CAG)₇C RNA相变过程中RNA在不同聚集体中的比例随时间的变化（图4b）。形成寡聚体RNA的上升伴随着二聚体（双链）RNA的下降，说明寡聚体主要通过二聚体的融合形成。在该过程中，双链粘性末端的stickers进攻另一双链的stickers，从而开启融合（图4c-d）。融合形成的寡聚体随即继续招募单聚体、二聚体和寡聚体，最终形成凝聚物（图4e）。

图4. GC-MD揭示在G(CAG)₇C RNA凝聚物形成的分子机理

最后，我们探究了sCAG RNA是否能在细胞内形成凝聚物。在转染24小时后，HEK293T细胞核中出现G(CAG)₇C RNA凝聚物，呈现类似液滴的状态，且与eCAG RNA形成的凝聚物状态相似（图5a-d）。当G(CAG)₇C RNA双链粘性末端的stickers被突变，其在细胞内形成凝聚物的能力则显著降低（图5e）。此外，G(CAG)₇C RNA 凝聚物与SC35共定位，表明sCAG RNA被招募至核斑点，可能影响RNA剪切功能。

图5. sCAG RNA在细胞内形成凝聚物并被募集至核斑点中。

本工作创新性地揭示了sCAG RNA形成具有3′-粘性末端的双链结构，其中GC粘性末端能够启动分子间交联，促进RNA凝聚体的形成。这一发现不仅为理解RNA相变及其生理功能提供了新的结构基础，还为基于RNA凝聚设计新型生物材料开辟了新途径，对于深入探索sCAG RNA在神经退行性疾病中的功能具有重要意义。

第一作者：万里祺，张成威，刘玉

通讯作者：韩达研究员，郭沛副研究员，陈广勇研究员

参考文献

[1] S. Mehta, J. Zhang, Liquid–liquid phase separation drives cellular function and dysfunction in cancer. Nat. Rev. Cancer 2022, 22, 239-252.

[2] C. Mathieu, R. V. Pappu, J. P. Taylor, Beyond aggregation: Pathological phase transitions in neurodegenerative disease. Science 2020, 370, 56-60.

[3] K. Matsuo, S. Asamitsu, K. Maeda, H. Suzuki, K. Kawakubo, G. Komiya, K. Kudo, Y. Sakai, K. Hori, S. Ikenoshita, et al., RNA G-quadruplexes form scaffolds that promote neuropathological α-synuclein aggregation. Cell 2024, 187, 6835-6848.

[4] G. M. Wadsworth, W. J. Zahurancik, X. Zeng, P. Pullara, L. B. Lai, V. Sidharthan, R. V. Pappu, V. Gopalan, P. R. Banerjee, RNAs undergo phase transitions with lower critical solution temperatures. Nat. Chem. 2023, 15, 1693-1704.

[5] A. Jain, R. D. Vale, RNA phase transitions in repeat expansion disorders. Nature 2017, 546, 243-247.

[6] J. Krol, A. Fiszer, A. Mykowska, K. Sobczak, M. de Mezer, W. J. Krzyzosiak, Ribonuclease Dicer cleaves triplet repeat hairpins into shorter repeats that silence specific targets. Mol. Cell 2007, 25, 575-586.

[7] O. Kimchi, E. M. King, M. P. Brenner, Uncovering the mechanism for aggregation in repeat expanded RNA reveals a reentrant transition. Nat. Commun. 2023, 14, 332.

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