课题组工作丨PNAS丨通用型RNA适体传感器设计新方法
功能RNA分子通过其特殊的三维结构在天然和合成生物系统中发挥着重要作用。然而，功能RNA的三维结构并非静态存在，对于特定的RNA序列，多种可能的三维构象作为动态结构集合的一部分，由信号引发多步骤的转变。对于RNA动态结构集合的描述可以捕捉保守进化模式，有助于人工进化和原理拓展，已经被用于RNA重复序列药物靶点的发现、RNA核酸适体的优化、以及提高sgRNA介导的基因编辑效率中。对于荧光RNA适体（Fluorogenic RNA Aptamers，FRApts）而言，静态结构的研究揭示了其荧光激活的机制，为改善其光学性质提供了宝贵见解，并用于活细胞中RNA的动态可视化研究。此外，各种基于FRApt的传感器已被用于核酸、小分子或蛋白质等生物活性分子的实时、非侵入性地监测，是活细胞内监测靶标动态变化的有力工具。然而，目前对FRApt传感器的结构-功能理解仅限于破坏与荧光团直接相关的结构，缺乏明确的指导原则以避免构建针对非核酸靶标传感器时耗时费力的序列验证。为了扩宽应用范围，简化设计过程，基于FRApt的传感器设计需要更通用的设计规则。
为了突破上述限制，谭蔚泓院士、韩达研究员团队开发了一种人工动态结构集合指导的通用RNA适体传感标签设计方法，相关工作以“Artificial dynamic structure ensemble- guided rational design of a universal RNA aptamer–based sensing tag”为题发表在《PNAS》上。该工作通过引入基序突变来创建人工动态结构集合，将稳定明亮的荧光RNA适体Pepper用于通用且可扩展的传感标签设计。
从RNA动力学的角度来看，FRApts明亮而稳定的发光性质表明发光构象在动态集合中占主导地位，需要更多能量进行重新分配；而FRApt传感器的动态结构集合中具有两种或更多种预先存在的构象，其丰度分布受靶标分子的影响。为了构建人工动态结构集合，Pepper被分解为关键调节域（蓝色）、被驱动元件（黄色）和保守序列（灰色）（图1A）。其中被驱动元件被设计为可以进行状态切换（StemON和StemOFF）的滑动茎。以滑动茎“5C·G”为例，NMR实验结果表明四环结构序列的不同（UUCG或AAAA）会造成几个亚氨基质子（G H1和U H3）的化学位移差异（图1B），对荧光状态具有显著影响。接下来，通过调节四环结构稳定性、滑动茎长度、以及限制滑动茎的状态切换等一系列序列设计，成功构建了人工动态结构集合SSPepper，并从荧光强度和自由能估算两个方面证明具有相同的滑动茎时，环的稳定性与荧光构象异构体的丰度成正比，顶端环（图1中以蓝色表示）越稳定，荧光信号越强（图1C-H）。
图1 通过设计动态结构集合开发SSPepper。
众所周知，RNA靶标识别元件与靶标形成复合物时的稳定性增加。根据人工动态结构集合得出的结论，调节结构域的稳定性是状态切换的根源，那么RNA识别元件能够以类似的原理用于克服能量屏障，通过滑动茎将靶标的识别状态传递给SSPepper，最终转化为荧光信号的输出（图2A）。按照相同的设计原则，通过构建一系列长度不同的滑动茎（图2B），可适用于多种类型的RNA靶标识别元件。体外表征表明，中等长度的茎始终保持荧光强度（图2C）、动态范围（图2D）和操作范围（图2E）之间的微妙平衡。通过比较EC50（图2F）和LOD（图2G），可以直观地评估SSPepper-Apt在低目标浓度下的性能。“参数调色板”具有不同的茎长度，可以在不同场景中选择最优传感标签，提供了一种即插即用的平台，简化了不同靶标传感标签的开发流程并实现快速集成。
图2 将SSPepper开发为“即插即用”的通用传感标签“SSPepper-Apt”。
接下来，作者将SSPepper-Apt用于哺乳动物细胞生物传感。为了避免基因编码荧光传感器的细胞内表达异质性所带来的误差，引入常亮的dBroccoli作为内参校正系统，将输出信号定义为R/G比例（SSPepper-Apt信号的平均值除以dBroccoli信号的平均值）。基于SSPepper-SAM的比率传感器被用于哺乳动物细胞内源性代谢物SAM的波动监测，在暴露于环亮氨酸10分钟内，R/G比例信号显著减弱，去除环亮氨酸后，R/G比率信号逐渐恢复到与初始平均信号相当的水平（图3A-C）。此外，SSPepper-TAR实现了活细胞内不同亚细胞定位（细胞核、细胞膜和细胞质）Tat多肽的响应成像，并且荧光强度与蛋白质丰度相关（图3A-D）。这些数据表明，基于SSPepper-Apt的比率传感标签实现了对活哺乳动物细胞中内源性代谢物的实时追踪和对多肽靶标的精确定位。
图3 基于SSPepper-Apt的即插即用比率传感标签用于活哺乳动物细胞中多种靶标的精准检测。
最后，作者将sgRNA与SSPepper整合为SSPepper-sgRNA，探索其在哺乳动物细胞中与CRISPR系统的兼容性。首先，将响应Cas9的SSPepper-sgRNA用于3号染色体上MUC4基因的成像，并尝试使用连续发光的dBroccoli来标记（图4A-B）。MUC4I2-SSPepper-sgRNA表现出与荧光蛋白标记的Cas9以及dBroccoli明显的共定位，形成分布在整个细胞核中可辨别点状信号（图4C），细胞核内点状信号的数量和大小证明了对MUC4的特异性成像（图4D-E）。此外，作者开发了一个预测模型，一系列靶向EGFP编码片段的sgRNA被整合为SSPepper-sgRNA（图4F），利用SSPepper-sgRNA体外对Cas9蛋白的荧光响应情况来预测活细胞中的基因编辑效率（图4G）。体外数据说明，不同sgRNA在Cas9缓冲液中荧光响应强度与切割效率高度相关（图4H）。细胞流式结果表明，体外荧光还与细胞中观察到的敲除效应密切相关，能够一定程度反映特定sgRNA的基因编辑效率（图4I）。
图4 SSPepper-sgRNA可良好兼容于CRISPR系统。
本研究通过开发人工RNA动态结构集合，合理构建了模型“SSPepper”，为动态结构集合的逐步调整提供了一个细致入微的视角。该模型生成了通用的基于荧光RNA适体Pepper的生物传感标签“SSPepper-Apt”，该标签具有可拓展性，能够便捷地整合各种RNA识别元件，组成性能优异的传感标签，实现了外加小分子、内源性代谢物、多肽的活细胞成像。SSPepper-sgRNA与活哺乳动物细胞中的CRISPR-Cas9系统表现出良好的兼容性，可作为预测基因编辑效率的有效工具。这一重大进步扩展了功能性RNA传感元件的应用场景，使得SSPepper-Apt成为一种在各种研究和技术应用中具有广泛潜力的宝贵工具。
该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目支持，上海交通大学医学院分子医学研究院博士研究生侯佳宁为该论文的第一作者，汪俊彦助理研究员、韩达研究员和谭蔚泓院士为通讯作者。
论文信息：J. Hou, P. Guo, J. Wang, D. Han, W. Tan, Artificial dynamic structure ensemble-guided rational design of a universal RNA aptamer–based sensing tag, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 121 (52) e2414793121. https://doi.org/10.1073/pnas.2414793121.
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