课题组工作丨ACS Nano丨多重原位成像位点特异性m6A甲基化

m6A是目前研究报道的RNA上最丰富的一种转录后修饰，在RNA生命周期的各个阶段发挥作用，包括翻译、核输出和选择性剪接等。越来越多的研究表明：m6A可以影响RNA分子的结构、活性和稳定性，显著影响细胞分化和癌症进展，意味着m6A甲基化的变化与疾病的发展有着复杂的联系。在单细胞水平上可视化位点特异性m6A甲基化将显著提高我们对其在细胞内各项活动中的关键调控功能的理解。尽管如此，目前针对位点特异性m6A的原位成像技术仍较少，而多个甲基化位点的同时可视化仍是一个未解决的挑战。

近期，中国科学院杭州医学研究所谭蔚泓院士、韩达研究员和彭瑞资副研究员团队开发了一种名为m6A-PHPEA的多重成像策略，可以实现位点特异性m6A甲基化的高分辨率、原位可视化。该方法使用一对探针分别在m6A甲基化位点和邻近的RNA进行杂交以确保靶标位点的高特异性，随后通过PER (primer exchange reaction) 进行信号放大，实现在细胞内单碱基分辨率的m6A成像。最后作者成功地在多种细胞类型中同时成像了三个不同的m6A甲基化位点，揭示了不同细胞表达水平的差异性。近日，该研究以题为“Multiplexed In Situ Imaging of Site-Specific m6A Methylation with Proximity Hybridization Followed by Primer Exchange Amplification (m6A-PHPEA)”的论文在线发表在ACS Nano。

文章具体的设计如图1所示，识别探针（探针R）通过m6A抗体识别m6A甲基化位点，并延伸出一条DNA链（Strand R），同时一个可寻址的探针（探针A）特异性地杂交到目标RNA序列。这两个探针的空间排列确保了m6A修饰位点的特异性和精确定位。探针R的构建使其能够直接识别m6A的甲基化，显著减少了实验步骤，提高了成像效率。连接探针connector与探针A和探针R杂交，然后暴露overhang，与预先制备的初级PER连接体杂交，随后是二级PER连接体和imager的杂交，最终形成一个稳健的信号放大过程。

图 1 m6A-PHPEA用于位点特异性m6A甲基化的多重成像

作者首先通过一系列体外实验验证了m6A-PHPEA方法的可行性，通过凝胶电泳验证PER产物的成功合成以及整个杂交体系成功形成 （图2b和2d）。随后通过流式细胞术评估该方法在检测位点特异性m6A甲基化方面的特异性。结果显示：只有当探针A和探针R同时存在时才能检测到阳性荧光信号，阴性对照组均没有产生荧光信号（图2f）。最后，作者考察了该方法的检测灵敏度，检测限约为0.5 nM，证实了m6A-PHPEA对检测特定RNA靶点上的m6A修饰的灵敏性（图2g）。

图 2 m6A-PHPEA的体外验证

随后作者利用m6A-PHPEA成功实现了HeLa细胞内ACTB mRNA 中m6A1216位点的单细胞成像。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示，只有当探针A和探针R同时存在时(i)，才能观察到明显的荧光信号，而没有任何一个探针（ii，iii）或者缺少connector (v)、初级PER产物（vi）或用随机序列替换探针A的组 (iv) 均无信号。统计分析证实靶标m6A mRNA的荧光信号与阴性对照有显著性差异，进一步验证了m6A-PHPEA的高特异性。

图 3 HeLa细胞中位点特异性m6A甲基化的原位CLSM成像

在成功对HeLa细胞中ACTB mRNA中的m6A1216位点成像后，作者进一步探索了m6A-PHPEA在不同RNA中m6A甲基化的多重成像的潜力。认识到目前多重m6A成像方法所面临的挑战，作者认为位点特异性m6A甲基化的多重特异和精确成像将显著提高我们对m6A生物学作用的理解。在设计并优化了一系列探针后，作者尝试在HeLa细胞中同时成像三个m6A修饰的RNA。如图4a所示，只有当探针A和探针R同时存在时，才观察到多重荧光信号；共定位分析显示三个荧光通道之间没有明显的重叠，证实了同时成像三个不同的m6A RNA的能力。最后，作者使用m6A-PHPEA测试经过Rhein处理的HeLa细胞来观察m6A修饰的动态，Rhein是一种已知的影响FTO活性并提高RNA甲基化水平的化合物（图4c）。免疫荧光结果显示Rhein处理后HeLa细胞的整体m6A水平显著增加（图4d和4e）。此外，三种RNA中的m6A水平都显著上升（图4f和4g），突出了这个策略捕获细胞m6A状态变化的能力。

图 4 三种不同的m6A RNA的多重成像

该研究工作开发了一种基于双特异性探针的接近杂交扩增方法m6A-PHPEA，用于位点特异性m6A修饰的原位成像。该方法能在HeLa细胞中可视化三个不同的m6A修饰的RNA，并通过战略性地设计正交的PER探针对来实现多重成像。此外，作者探讨了化学刺激下m6A甲基化的动态变化，有助于更深入地了解m6A的生物学作用。作者指出虽然目前成像通量有限，但后续可以通过使用不同的DNA编码策略或使用DNA交换的序列成像显著提高通量。总的来说，m6A-PHPEA可以作为m6A研究的一个有价值的工具，促进对这种表观遗传标记的更微妙的分子理解。它也可能对癌症的诊断和治疗有意义，并对表观转录组学领域提供有价值的见解。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acsnano.4c08407

第一作者：宋明慧 （2022级博士）

通讯作者：谭蔚泓院士，韩达研究员，彭瑞资副研究员