Angew | 以突变对抗突变：进化改造核酸适体用于识别 SARS-CoV-2 突变刺突蛋白

本文的通讯作者是加拿大麦克马斯特大学生物化学及药学系教授李应福。他的主要研究的领域包括功能核酸, 生物传感, 纳米技术和non-coding RNAs。

【背景介绍】

COVID-19对世界产生了巨大影响，病毒变体的迅速出现使诊断工具的准确性降低，亟需识别分子以检测由突变引起的新变体。其中Omicron与之前的检测到的变体不同，它在刺突蛋白(SP)和受体结合域(RBD)中含有更多的突变，这两个区域都是病毒进入宿主细胞的关键。研究人员通过开发与SARS-CoV-2结合的核酸适体，可以迅速对COVID-19做出反应。由于S蛋白不断发生突变，因此必须确保在特定时间内获得高特异性和高亲和力的核酸适体。到目前为止，每个已发表的S蛋白核酸适体都是从完全随机序列的文库中选择的。虽然这是获得核酸适体的常用方法，但完全随机的序列可能无法快速进化出高亲和力的核酸适体来处理快速突变的S蛋白。因此作者假设可以用核酸适体本身的突变来对抗S蛋白的突变，即通过从现有的部分随机核酸适体中筛选核酸适体，以增强对新突变蛋白的识别。

【结果与讨论】

1. 从突变DNA核酸适体库中选择BA.5 S蛋白结合核酸适体

部分随机文库是根据之前筛选的核酸适体MSA52的序列设计的，被证明可以有效识别来自多种变异的S蛋白，如Alpha, Beta, Gamma和Delta，平均Kd为~6 nM。其中在MSA52的40nt随机区域的每个核苷酸位置上创建24%的突变率(图1A，红色核苷酸)。靶蛋白为Omicron变体BA.5 SP，传播速度快，致病性强。总共进行了12轮筛选。为了获得高亲和力的核酸适体，通过降低DNA和BA.5 SP的浓度，逐渐增加选择压力。然后对第12轮(G12)进行高通量测序，使用斑点印迹法(dot-blot assay)测试了前4个簇的亲和力，结果表明MBA5SA1簇对BA.5 SP具有非常高的亲和力。接下来，比较了MBA5SA1与其亲本核酸适体MSA52的序列，比对了它们的随机序列结构域(图1B)，发现MBA5SA1与MSA52的突变率为55%。

图1 SARS-CoV-2 BA.5变体S蛋白高亲和力DNA核酸适体MBA5SA1的发现

2. MBA5SA1对BA.5的S蛋白具有很高的亲和力

使用斑点印迹法评估了MBA5SA1对几种S蛋白变体的结合亲和力（图1C）。除了BA.5 SP外，还测试了野生型(WT SP)和Delta变体(B.1.617.2 SP)的S蛋白。MBA5SA1对BA.5 SP的亲和力比MSA52高得多，Kd为0.065 nM，MSA52 的Kd为7.0 nM (图1C)。然而，MBA5SA1完全失去了结合B.1.617.2 SP的能力，对WT SP的亲和力明显减弱 (图1C)。与MSA52不同，MBA5SA1对BA.5的S蛋白亲和力非常高，但对非Omicron变体的S蛋白较差。可能是由于BA.5 SP在筛选中被用作唯一的靶标，并且在选择过程中该靶标和DNA库的浓度都在逐渐降低，以驱动高亲和力核酸适体的选择。

3. MBA5SA1具有识别多种Omicron亚变体S蛋白的能力

然后评估了MBA5SA1与6个Omicron变体的S蛋白的结合亲和力，包括BA.1、BA.2、BA.4.6、BA.5、BF.7和BQ.1.1(图2A)。MBA5SA1对所有的Omicron亚变异S蛋白均表现出较高的结合亲和力，Kd值在0.043 ~ 0.152 nM之间，其中对BA.2的亲和力最高，Kd 为0.043 nM。

基于MBA5SA1对Omicron变体S蛋白的高亲和力，使用表达BA.1、BA.2或BA.5的S蛋白的假病毒（PV）模拟。以及不含任何S蛋白的对照病毒(CV)组和核酸适体对照组(MC)。如图2B所示，MBA5SA1对BA.1、BA.2和BA.5 PV的Kd值分别为132.6、35.6和94.5 fM。这些结果表明MBA5SA1能够识别病毒颗粒上的S蛋白。

然后评估MBA5SA1对人唾液中Omicron变体S蛋白的特异性识别，使用了一系列蛋白作为对照。如图2C 所示，MBA5SA1与Omicron变体S蛋白(BA.2 SP、BA.4.6 SP、BA.5 SP和BQ.1.1 SP)特异性结合，而与对照蛋白没有明显结合。本实验表明，MBA5SA1对多种Omicron变体的S蛋白具有高特异性和高亲和力。

图2 MBA5SA1与各种亚变体S蛋白的结合

4. 基于MBA5SA1的三明治比色法检测临床唾液样本

MBA5SA1具有非常高的靶向性，有望直接用作检测唾液中Omicron变体的生物传感器。为了检验这种可能性，使用图3A中的设计对40份阴性唾液样本和43份阳性唾液样本进行了检测。结果表明，ELABA能够检测到人类唾液中的多种Omicron变体，但对野生型SARS-CoV-2和Delta变体的样本表现出很弱的信号响应。与最近报道的同样的ELABA测定，使用由MSA52构建的三聚体DNA核酸适体(TMSA52)。MBA5SA1-ELABA和TMSA52-ELABA表现出相当的性能，且优于MSA52-ELABA。这一发现表明，MBA5SA1的良好亲和力使得开发临床有用的检测方法无需设计三聚体核酸适体，从而降低了实验复杂性。

图3 基于MBA5SA1的酶联核酸适体结合试验(ELABA)的临床评价

5. 二级结构和MBA5SA1的截短

利用mFold预测了MBA5SA1的二级结构如图4A所示。整体结构包含5个配对(P1、P2、P3、P4和P5)，3个环(L3,L4和L5)和5个单链(SS12、SS23、SS42、 SS25和SS51)。同时设计了12个截短体(图4B-F，命名为MBA5SA1-T1至MBA5SA1-T12)，并通过斑点印迹法检测其与BA.5 SP的结合情况。最终构建了一个新的构建物MBA5SA1-T12(图4F)，它包含61个核苷酸，比亲本序列减少了18个核苷酸。MBA5SA1-T12对BA.5 SP具有更高的亲和力，Kd为0.043 nM(图4F)。

图4 提出MBA5SA1的二级结构，并对序列进行截短

6. 追踪MBA5SA1的进化轨迹

鉴于MBA5SA1的高亲和力，为探究如何以及何时从DNA库中产生的。通过对G1-G12进行深度测序，并对数据进行分析，追踪MBA5SA1的进化轨迹。分析发现：7个MBA5SA1变异，只在位置4、13和25(图5A中突出显示的红色核苷酸)发生变化。同时计算了每一代中每个变异的频率(图5C)，它被定义为给定变异在测序池中的比例。图5D绘制了MBA5SA1的7个突变体在每代中的变异频率。通过对这些数据的仔细评估，在图5E展示了这些突变体可能的进化轨迹。

在选择中出现的第一个MBA5SA1突变体是GTG突变体，在G3中检测到(图5C)。也是G5的最优势序列。而GTG突变体的频率从G6起显著降低，同时出现了另一个突变体GCG突变体。GCG突变体很可能是GTG突变体通过T13到C13的突变而衍生的，因为它对BA.5 SP具有更好的结合亲和力，比GTG突变体竞争力更强(GCG突变体的Kd为0.32 nM，而GTG突变体的Kd为2.58 nM)。

另一个突变体MBA5SA1-ATG也出现在G4中，并表现出与GCG突变体相似的进化特征。ATG突变体也被认为是GTG突变体的衍生物，G4突变为A4。

MBA5SA1的另外两个突变体GTT和GCT出现在G5中。作者认为GTT是从原始GTG突变体突变而来的(相差一个核苷酸)，而GCT是GCG突变体的衍生物(相差一个核苷酸)，而不是直接来自GTG(相差两个核苷酸)。测序数据还表明，GTT突变体出现时间早于GCT突变体。在亲和性方面，GCT突变体(Kd = 0.095 nM)优于GTT突变体(Kd = 0.20 nM)。说明GCT是由第二代GCG突变体突变而来，而GTT是直接由第一代GTG突变体突变而来。

下一个出现的突变体是ATT，它在G6中首次出现。该突变体在7个MBA5SA1突变体中的亲和力最好(Kd=0.065 nM)，但其较高的亲和力(Kd = 0.065 nM)可能是其与G9-G11的GCT突变体保持高度竞争并最终成为G12中最显性突变体的原因。

在选择中出现最晚的是ATC突变体，它最早出现在G8。认为它是从ATT突变体进化而来的，由T25突变为C25。

图5 通过深度测序分析MBA5SA1的进化轨迹

【结论】

本文提供了一个研究案例，从DNA库中寻找高亲和力的核酸适体，用于快速突变的病毒蛋白靶标，该DNA库是通过对最初分离的识别亲本蛋白的现有核酸适体进行部分随机突变而产生的，用(DNA核酸适体上的)突变来对抗(蛋白靶标上的)突变。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202415226