JACS丨酶催化驱动的DNA合成的游泳体
大家好，今天为大家分享的文献是2024年4月发表于JACS上的“Synthetic DNA-based Swimmers Driven by Enzyme Catalysis”。
图1 基于酶催化驱动的DNA合成的游泳体
作者介绍
本文的通讯作者是来自罗马大学化学系的Francesco Ricci教授。Ricci课题组的研究涵盖了DNA纳米技术、生物工程、超分子化学和合成生物学等领域。具体包括基于自然学习的DNA功能纳米开关设计、即时诊断与智能药物释放系统的构建、自组装三维DNA分子机器三个主要研究方向。
研究背景
合成纳米机器因其在生物传感、药物递送和释放方面的潜力，其运动控制已成为研究热点。研究人员已经展示了如何利用磁场、光、超声波和化学反应等外部能量来驱动微纳米级系统在液体中的运动。最近，一种新型的酶驱动马达，配备了对pH变化敏感的DNA纳米开关，能够根据周围环境的pH值自我运动。尽管如此，这些酶驱动的微/纳米马达所使用的材料（如金属、二氧化硅和聚合物）可能存在潜在的毒性，这限制了它们在临床医学中的应用。此外，如何有效地在微/纳米分子机器表面进行酶的功能化修饰，以及如何控制酶的分布和浓度，也是当前亟待解决的挑战。为了应对这些挑战，本研究将合成DNA的可编程性和响应性与酶催化相结合，开发了一种基于DNA自推进的游泳者（简称DNA-酶游泳者）。作为模型系统，研究者合成了一种酶修饰的管状DNA结构，这种结构能够在酶底物存在的情况下，独立且无阻碍地移动（游泳），如图2所示。这种DNA-酶游泳者的设计，不仅展示了DNA在纳米机器运动控制中的潜力，也为未来的生物医学应用提供了新的可能性。
图2 DNA-酶游泳者的设计原理(DNA−enzyme swimmers)
结果讨论
在本研究中，作者采用了DNA结构作为酶驱动游动体的分子骨架。这个骨架是由DNA瓦片在室温下通过相互作用自组装形成的微米级中空管状结构。这些DNA瓦片是由五种不同的DNA链通过精确的杂交过程构建而成，每条链都具有四个特殊的黏性末端，这些末端负责促进自组装过程。为了使这些管状结构在实验中易于观察，在形成DNA瓦片的链的5'端连接了Cy3荧光团。此外，在DNA瓦片上设计了一个30个核苷酸（nt）的单链锚定域，这个锚定域可以通过酶的功能化进行修饰（如图3a所示）。这种设计不仅提高了结构的可视化，而且通过酶的功能化增强了其在生物医学应用中的潜力。。
图3 基于DNA-脲酶结构的设计与构建。
在酶的功能化研究中，首先选择了脲酶，因为它能够将尿素（CO(NH2)2）转化为铵（NH4+）和碳酸盐（CO32−），产生推进力。随后，采用叠氮化物-炔环加成（SPAAC）技术将脲酶偶联到二苯环辛基（DBCO）修饰的单链DNA（ssDNA）上，并通过阴离子交换层析法纯化得到DNA-酶偶联物（见图2b）。为了优化酶功能化的条件，在自组装过程中使用了不同比例的含锚链和不含锚链的DNA瓦片，从而组装出具有不同百分比分布的锚链DNA结构（见图2c-d）。实验结果显示，随着与锚链结合的瓦片百分比的增加，酶的绑定率也在提升，直到稳定在30%时达到最佳状态。接着，研究了脲酶沿DNA结构的分布情况。例如，Cy3-DNA结构的平均长度为5.0±0.3 μm，而Cy5-脲酶的平均长度为4.4±0.1 μm；计数方面，Cy3-DNA的密度为3.3±0.6 × 10^3计数/mm²，Cy5-脲酶为3.6±0.4 × 10^3计数/mm²，通过这些测量可以比较Cy3（DNA瓦片）和Cy5（酶）的信号（见图2f）。同时，通过对DNA瓦片和脲酶在单个DNA结构整个长度上的像素强度分布进行分析，能够表征酶的分布情况（见图2g），并借助共定位因子的计算（见图2h），评估脲酶信号（Cy5）与DNA结构信号（Cy3）之间的重叠程度。以上结果表明，脲酶与DNA瓦片之间存在高度的共定位关系。。
图4 基于脲酶推动的“DNA-酶游泳者”。
为了探索酶功能化DNA结构的移动能力，研究者们追踪了DNA-酶游泳者在不同尿素浓度（0, 100, 和 300 mM）下的运动轨迹（见图3 a-c）。结果显示，随着尿素浓度的增加，DNA-酶游泳者的有效位移（MSD）呈现出浓度依赖的显著相关性，运动模式从线性扩散转变为非线性MSD的自我推进（见图3d）。进一步的研究揭示了随着底物浓度的增加，DNA-酶游泳者的有效扩散系数（见图3e）和有效速度（见图3f）均显著提升。
在另一项实验中，研究者选择了过氧化氢酶作为DNA-酶游泳者的驱动力，该酶能够将过氧化氢（H2O2）转化为水和氧气，从而实现自我推进。实验首先采用了30%带有锚链的DNA瓦片来功能化DNA纳米结构（见图4a）。荧光显微镜图像（见图4b）显示了过氧化氢酶（Cy3）成功结合在DNA表面纳米结构（Cy5）上。通过测量Cy5 DNA结构和Cy3过氧化氢酶的平均长度及荧光计数，研究者们发现过氧化氢酶沿整个DNA纳米结构分布（见图4c）。通过分析DNA瓦片和过氧化氢酶沿DNA结构的像素强度曲线，研究者们发现酶的分布呈现出一定程度的异质性（均匀性因子：0.8±0.1）（见图4d,e）。此外，研究者们再次证实了过氧化氢酶与DNA结构的高度共定位（共定位因子为0.9±0.1）（见图4e）。
最终，DNA游泳者展现出了更长的运动轨迹（见图4f），更高的有效位移（MSD）（见图4g），更高的有效扩散系数（见图4h）以及更高的速度（见图4i），这些结果进一步证明了酶功能化DNA结构在生物医学领域的应用潜力。。
图5基于过氧化氢酶驱动的“DNA-酶游泳者”运动。
最后，作者重新设计了上文所述的脲酶驱动DNA 游泳者，以便其运动可以在特定DNA链存在时被阻止(这里定义为DNA“刹车”)。为此引入了与酶相连链互补的DNA链，即一个额外的10-nt 单链DNA部分，可以作为“支撑点”结构域。然后设计了一个DNA序列(brake)，当它结合到这个结构域时，可以取代结构上的酶，并有效地阻止DNA 游泳者的运动(图5a)。荧光显微成像对DNA 结构的结构表征表明，DNA 制动成功地取代了结构上的脲酶，同时不影响DNA结构的稳定性(图5b)。为了证实这一点，作者计算了添加 DNA制动前后脲酶修饰的组装瓷砖的数量，发现超过85%的最初结合到结构上的脲酶被移位。7×106 vs 0.5±0.1×106计数/mm2)(图5c)，而在添加DNA制动器之前和之后，组装瓷砖的数量保持不变(7.6±0.8×106 vs 8.0±0.8×106计数/mm2)(图5c) 然后测量了在添加DNA刹车之前和之后DNA游泳者的运动，DNA游泳者表现出更短的轨迹(图5d)，更低的MSD(图5e)，更低的有效扩散系数(图5f)，以上数据表明分子DNA制动器可以有效阻断酶诱导游泳者运动。
图6基于脲酶驱动“DNA-酶游泳者”被分子DNA制动器阻止
总结
在本研究中，研究者通过自组装技术利用杂交DNA瓦片构建了管状DNA纳米结构，并成功地将脲酶和过氧化氢酶修饰到这些DNA合成纳米结构上。通过利用酶底物（尿素和H2O2）转化为溶液中的产物，实现了“DNA-酶游泳者”的自我推进运动。实验数据清晰地展示了这些游泳者表现出浓度依赖性的运动特性和增强的扩散能力。此外，基于“DNA-酶游泳者”的可编程性，研究者设计了特定的DNA分子链，这些链能够取代DNA支架上的酶，从而充当DNA游泳者的分子“制动器”。这一创新设计不仅展示了对DNA游泳者运动的精确控制，而且为开发基于合成DNA的酶动力游泳器提供了原理上的证明，这种游泳器能够在液体环境中自行推进。这些研究成果不仅在合成生物学和纳米技术领域具有重要意义，而且为未来在生物医学应用中，如药物递送和生物传感等领域的开发和应用奠定了坚实的基础。
原文链接
Tania Patiño Padial*, Erica Del Grosso,Serena Gentile, Lorena Baranda Pellejero, Rafael Mestre, Lars J. M. M. Paffen, Samuel Sánchez, and Francesco Ricci*. Synthetic DNA-based Swimmers Driven by Enzyme Catalysis. J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 12664−12671. https://doi.org/10.1021/jacs.4c02094
