Mol Cell | 核内PKM2结合pre-mRNA上的G4显示其基因调控功能
大家好，今天给大家分享的文献是发表在molecular cell上的一篇文章，题目是Nuclear PKM2 binds pre-mRNA at folded G-quadruplexes and reveals their gene regulatory role。通讯作者是来自美国国立卫生研究院的研究员Markus Hafner，其研究方向是RNA的分子和生物学功能。
背景介绍：
PKM2是一种丙酮酸激酶，越来越多的证据表明PKM2在肿瘤中促进了有氧糖酵解、细胞增殖、迁移和存活。癌症中普遍观察到，PKM2的非代谢活动可能与其核内转移有关，并有助于肿瘤的进展和侵袭性，表明PKM2可能通过未知的分子机制参与基因调控。rG4 由两个或多个通过 Hoogsteen 氢键堆叠的鸟嘌呤四联体形成，是最稳定的结构之一。但rG4在体内功能以及调控机制仍未完全探明。本文探索了rG4s是一种癌症调控因子以及其机制，而PKM2能够高亲和力结合rG4s，且PKM2-rG4能作为靶点来控制肿瘤进展。
结果与讨论：
- rG4 RNA 结合PKM2
首先作者根据已有的研究基础，以蛋白为中心（PKM2）进行体外结合序列的筛选，构建了一个29-mer RNAs文库，研究了PKM2的结合序列（Fig1.A）。然后，通过分析这些结合序列的特征，作者发现具有GGG-containing 5-mers序列特征的序列具有更高的亲和力（Fig1.B），并且这种序列具有经典rG4的特征（Fig1.C）。为了进一步探究PKM2与rG4的特异性结合，作者发现在K+离子条件下（稳定rG4），PKM与含有不同个数GGG序列的结合亲和力更强(Fig1.D)。并进一步通过EMSA、G碱基突变（破坏rG4 Hoogsteen配对）证明了PKM2特异性结合含rG4的序列。
Fig1. rG4 RNA 结合PKM2
- HNRNPF结合非结构化的rG4序列
为进一步探寻还有哪些rG4结合蛋白，作者对ENCODE database中的rG4 RBP进行验证，发现HNRNPF是另一个潜在的rG4 RBP（Fig1.G）。同样，作者发现在Li+条件下（破坏rG4结构），HNRNPF与rG4的结合亲和力更强（Fig1.HI）。并且，随着GGG重复数的增加，PKM2对结构化的rG4序列亲和力也逐渐增加（Fig1.J）。而HNRNPF虽然不结合折叠rG4序列，但与PKM2可能存在竞争结合的关系，也将其纳入后续的研究中。
- 核内PKM2 和HNRNPF结合pre-mRNA rG4
接着，作者采用fPAR-CliP探究了在细胞内PKM2和HNRNPF的rG4结合序列（Fig2.AB）。结果显示，内源性细胞核内的PKM2和HNRNPF结合了更多含rG4的序列。并且这两种蛋白都对G-rich序列有偏好性，并且结合位点也具有相似性（Fig2.CD）。然后，作者对鉴定到的rG4序列（PLOD1基因）进行EMSA，发现PKM2确实能结合rG4序列，并且其活性形式PKM2pS37亲和力更高（Fig2.E）。将PKM2和HNRNPF与广泛报道的rG4结合蛋白（如DDX3X、DHX36）等进行对比，本文报道的蛋白具有更强的rG4序列偏好性（Fig2.FG）。
Fig2. 核内PKM2 和HNRNPF结合pre-mRNA rG4
- PKM2和HNRNPF竞争性结合rG4
由于PKM2和HNRNPF蛋白具有结合序列的相似性，作者进一步探索是否存在竞争性结合的现象。作者分析了fPAR-CliP数据，发现两种蛋白对于结合位点有高度相似性，对结合序列也有较高程度的重叠（Fig3.ABC）。并且通过cas9 在PKM2插入核输出信号（NES）后，HNRNPF对含rG4序列的结合增强，佐证了存在竞争性结合的现象（Fig3.D）。
Fig3. PKM2和HNRNPF竞争性结合rG4
- 核内PKM2和HNRNPF对含rG4 mRNA的表达具有相反效应
作者在PKM2插入核输出信号（NES）后，降低了核内PKM2水平，而rG4 mRNA的表达也随之降低（Fig4.AB）。而在PKM2插入核输入信号（NLS）后，提升了核内PKM2水平，增加了rG4 mRNA的表达（Fig4.CD）。并且这种提升程度取决于外显子中或靠近剪接位点（<200 nt）的rG4数量。与PKM2的效应相反，增加核内HNRNPF能够减少rG4 mRNA的表达（Fig4.EF）。
Fig4. 核内PKM2和HNRNPF对含rG4 mRNA的表达具有相反效应
- 核内PKM2 以共转录的方式促进了rG4 pre-mRNA的表达
为了确定PKM2对转录的影响，作者通过ChIP-seq，确定了RNA Pol ⅡCTD以及磷酸化形式 RNA Pol ⅡCTD phosphor-S2的结合位点，发现RNA Pol ⅡCTD在含rG4 pre-mRNA转录起始位点的占据减少，而磷酸化形式占据增加（Fig5.AB）。这说明PKM2可能增加了含有rG4 pre-mRNA的转录。并且，内含子上含有rG4 的pre-mRNA转录增加；而有内含子的rG4 pre-mRNA与无内含子rG4 pre-mRNA的比例不变（Fig5.CD）。说明PKM2影响了转录但不影响转录后的剪切等过程。
Fig5. 核内PKM2 以共转录的方式促进了rG4 pre-mRNA的表达
- rG4 mRNA在EMT过程中上调
作者发现：提升了PKM2蛋白水平后，与肿瘤相关基因的表达增加，尤其是上皮-间充质转换相关基因EMT（Fig6.A）。为了探索rG4是否和EMT过程相关，作者分析了1个乳腺癌EMT模型的基因表达数据。在这个模型中细胞可以分为3种表型状态，包括基本状态（E）、上皮/间充质混合状态（E/M）、间充质状态（xM）。作者发现当细胞从E状态过渡至E/M状态时，核内PKM2过表达后rG4转录组增加，HNRNPF与之相反（Fig6.B）。细胞处于E/M状态时，rG4转录组增加（Fig6.C）。细胞从E/M状态过度到xM状态时，rG4转录组降低（Fig6.E）。这说明，PKM2可能是通过影响上皮/间充质转化过程来影响癌症相关进程。
Fig6：rG4 mRNA在EMT过程中上调
- 排除PKM2可以减少小鼠异种移植中的肺转移
分析TCGA测序数据发现：几乎所有的癌症亚型种，rG4 mRNA的高表达均与不良预后相关。（Fig6.F）。而作者在先前的研究中发现的小分子TEPP-46可以抑制核内PKM2的表达并减少了细胞迁移和侵染（Fig6.GH）。然后作者构建了PKM-NES-FH的MDA-MB-231细胞并排除了对能量代谢的影响（Fig7.AB）。发现PKM在核内的耗竭减少了细胞迁移（Fig7.C）。并且将细胞异种移植至裸鼠后，肿瘤生长更慢，存活时间更长（Fig7.DEF）。对原发肿瘤组织进行RNA测序，发现含rG4 RNA表达减少（Fig7.G）。并且肿瘤转移的相对大小降低至1/5（Fig7.H）。
Fig7：排除PKM2可以减少小鼠异种移植中的肺转移
总结：
本文发现PKM2结合pre-mRNA中的rG4位点，并且折叠和未折叠rG4的平衡关系控制含有rG4 mRNA的转录输出。而rG4 mRNA组编码上皮/间充质转化（EMT）基因，从细胞核内去除PKM2可以降低肿瘤的生长和转移。
