Nat Commun丨通过 RNA 转录激活对哺乳动物细胞进行条件性 RNA 干扰
大家好，今天分享的文献是2024年8月发表在Nat Commun上的“ Conditional RNA interference in mammalian cells via RNA transactivation（通过RNA转录激活对哺乳动物细胞进行条件性RNA干扰） ”。
有关作者：
本文作者是波士顿大学生物医学工程系的Alexander A. Green教授，实验室主要方向包括利用RNA网络设计细胞传感和计算系统，低成本便携式病原检测，新型抗菌材料等。代表工作有设计基于Toehold switch的ribocomputing元件用于细胞内复杂逻辑运算，以及将编程化Aptaswitch RNA用于快速核酸检测。
研究背景：
- RNA interference (RNAi)
哺乳动物 miRNA 的biogenesis, 合成 RNAi 触发过程和 RNAi 介导的基因沉默
RNA interference (RNAi) 的代表方式有miRNA或递送siRNA，通过转录后调控选择性地沉默靶基因表达。其中，哺乳动物细胞的pri-miRNA在细胞核内转录，接着被细胞核内的microprocessor：Drosha-DGCR8复合物切割产生约60-70 nt的short hairpin RNAs，称为pre-miRNA。pre-miRNA被Exportin 5结合并转运至细胞质中，被Dicer和TAR RNA结合蛋白（TRBP）结合，Dicer切割pre-miRNA的末端loop，形成20-22 nt 的RNA双链并与Ago蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），在Ago2蛋白的催化下保留引导链，丢弃正义链，形成成熟的RISC复合物与mRNA的互补，抑制mRNA转录或导致其降解调节基因表达。siRNA则通过内吞和内体逃逸进入细胞质，与Dicer和TRBP结合，触发与上述类似的RNAi过程。
但是RNAi的应用仍然存在缺陷，如siRNA递送会干扰内源干扰机器的运转，miRNA的触发缺乏时空控制，容易造成较大的副作用，因此应用于哺乳动物细胞的RNAi的条件性激活方法仍然有待开发。本文通过研究RNAi 途径中 RNA 底物和必需酶之间的分子识别机制，利用顺式调控 RNA 元件来控制细胞中微处理器的识别，对特定 RNA 刺激作出反应，生成RNA触发的正交RNAi系统 (Orthogonal RNA Interference induced by Trigger RNA , ORIENTR)，建立应用于哺乳动物细胞中的RNAi电路。
结果与讨论：
- ORIENTR 的设计和性能
图1. pri-miRNA底物的结构特征和序列基序。
首先，作者探究了pri-miRNA的结构特征对Microprocessor 的影响。Microprocessor 对应的RNA底物具有典型的结构特征：apical loop; upper stem长度约为22 bp, 含有用于mRNA沉默的正义链和反义链；basal stem 长度为11 bp，不完全互补，11 bp的长度是指导 Drosha 切割的分子标尺；同时两侧具有单链RNA（图1A）。作者选择了具有典型Pri-miRNA结构的，具有高分辨率结构解析的 pri-miR-16-2作为支架，通过将原始 miR16-2 序列与病毒 miRNA 序列 (miR-HSUR4)交换用于沉默含有 miR-HSUR4 靶位点的绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因，以直接监测 RNAi 活性。作者将支架的基干序列进行更改，发现仅当互补产生稳定茎部时，能够产生对应的miRNA沉默GFP基因表达，证明基干部分需要的是保守结构而不是保守序列（图1B）。根据以上结论，作者设计了ORIENTR系统，基干底部茎 5ʹ 一半的 11 nt 序列被隔离在发夹结构中，以防止正确的pri-miRNA底物结构折叠。被破坏的基茎折叠阻止 Drosha获取和处理底物pri-miRNA。通过传感器域中Toehold介导的链置换与 37 nt 同源 RNA trigger相互作用，打开这个上游发夹,释放了隔离的11 nt序列并重新形成基干结构，激活 Drosha识别，从而启动 miRNA 生物合成以生成成熟的功能性amiRNA作为输出（图1C）。 作者通过NUPACK生成了19个具有相应同源trigger RNA 的 ORIENTR 装置，ORIENTR和triggerRNA质粒以及报告GFP质粒被共转染到HEK293T细胞中。大多数在同源触发存在下，细胞显示出较低的 GFP 荧光（图 1D）。
- 优化 ORIENTR 结构
图2. 通过二级结构调整实现具有较低泄漏的正交 ORIENTR 库。
大多数ORIENTR虽然能够实现同源RNA的触发，但是仍然存在折叠缺陷导致的amiRNA泄露和同源RNA激活的动态调控不足的问题，因此，作者选择了表现较好的ORIENTR-2为基础，通过底部茎的长度变化，bulge大小，以及3’ 增加hairpin结构的方式进行二级结构优化，试图降低泄露（图2A）。结果表明，隔离臂和下游侧翼序列的构象会影响信号泄漏和对RNA trigger的响应灵敏度（图2B），其中，2-4通过增加与3ʹ 基底茎弱碱基配对的 6-nt结构域降低了表达泄露。作者进一步将这个3’茎环结构添加到图1中有效果的序列中，相比于没有添加6-nt结构域，大多数序列在输入trigger RNA时效果有提升，但是具体增强的效果因序列而异（图2C, D）。作者进一步通过Northern Blot验证了六个ORIENTR装置及其trigger的正交性，方法是将每个ORIENTR与所有六个trigger分别共转染，并验证全细胞提取物中amiRNA生成量（图 2E）。六个装置都表现出高度正交性，只有在存在同源trigger器的情况下才会观察到amiRNA生成增加。
- 优化 ORIENTR 结构
图3. 使用 dCas13d 增强 ORIENTR 动态范围。
接下来，作者旨在通过增强 ORIENTR 与trigger RNA的相互作用来增强调节动力学。由于Microprocessor调节发生在细胞核中，作者首先研究了ORIENTR和triggerRNA的定位，研究结果显示大多数ORIENTR trigger RNA（图3A）被输出到细胞质中。为了提高trigger RNA 的性能，作者使用rfxCas13d的CRISPR RNA（crRNA）支架发夹替换了triggerA和B 中的 5ʹ 保护发夹，在与失活的dCas13d结合后，起到保护其免受降解的作用，并通过核定位信号肽运输至细胞核中（图3B）。单独的cr-trigger RNA生成 amiRNA 的效果不如原始trigger RNA（图3C中ORIENTR_A和B的泳道5与泳道3），可能是因为 crRNA 支架发夹不如原始5ʹ 发夹稳定，无法保护 RNA 免于降解。在存在 dCas13d 的情况下（图3C中的泳道4），cr-trigger RNA显著促进了amiRNA的产生，同样作者通过荧光素酶报告基因定量测量了ORIENTR_A的RNAi效率，证明蛋白质介导的RNA稳定和定位可能是增强哺乳动物细胞中 RNA 开关性能的通用策略。
- 利用ORIENTR感知和敲除内源性mRNA
图4. 利用 ORIENTR 感知和调节内源基因。
作者进一步研究ORIENTR 是否可用于感知内源 RNA 转录本。在 HeLa 细胞中，42℃ 热休克后Hsp70 mRNA丰度可显著增加，作者针对其设计了74 nt Toehold的ORIENTR，产生的amiRNA用于敲低荧光素酶，当细胞被热激时，报告信号相对于37℃下的水平降低了26%（图4B）。接下来作者将ORIENTR用于靶向内源基因。作者设计了两组靶向KRAS的amiRNA并将它们整合到ORIENTR_A 的支架中，在两种情况下，trigger RNA的存在都显著增加了amiRNA的产生（图4C）。通过RT-PCR和WB（图4D）评估基因敲低效率，均显示出触发诱导的KRAS抑制。总之，这些结果表ORIENTR 的内置模块化可用于感知和调节细胞内感兴趣的基因。
总结：
- 系统地验证功能性pri-miRNA的序列和结构要求。
- 设计提供条件性 pri-miRNA 活性的 RNA 开关。
- 通过利用独立的ORIENTR传感器或执行器域，作者证明了ORIENTR可以检测内源性mRNA并敲低感兴趣的内源性基因。。
文献信息：
Zhou, Y., Sheng, P., Li, J. et al. Conditional RNA interference in mammalian cells via RNA transactivation. Nat Commun 15, 6855 (2024).
https://doi.org/10.1038/s41467-024-50600-w
