ANGEW | 使用活性液滴调节核酸催化
大家好，今天给大家带来的是一篇发表在Angew Chem Int Ed上的文章，题目为Regulating nucleic acid catalysis using active droplets.
【通讯作者】
汉内斯·穆奇勒，马克斯普朗克生物化学研究所的独立MaxSynBio小组负责人。研究方向：自我复制和进化的仿生系统的从头工程，和生命的起源以及短RNA在合理的条件下催化生化反应的潜力。
约伯·博霍文，慕尼黑工业大学自然科学生物科学系副教授，研究方向：化学能调节分子自组装，以及生命的合成。
作者引入了一种化学燃料活性液滴系统，当供应有限量的燃料时，系统将暂时产生活性的液滴，直到所有燃料都被消耗掉。它们对燃料的依赖性使它们成为测试瞬时区室化如何影响反应网络中的生物催化剂的理想模型。
活性液滴系统主要由长poly U，短阳离子肽和碳二亚胺（燃料）组成，调控液滴中的17E DNAzyme。系统的机制主要是短阳离子肽的 C 端与燃料发生反应，生成相应的酸酐，总电荷由 +1 增加到 +3。电荷的暂时增加，使活化肽能够形成凝聚体液滴，系统被激活。燃料耗尽后，酸酐自发水解，回到原始状态，系统失活。
2. 改造DNA酶,增强分配能力
图2，DNAzyme 的分子设计控制其在瞬时液滴中的分配
由于原始的DNAzyme在液滴中的分配能力弱，作者通过在DNAzyme的每个末端都添加了一个A10“分配臂”，促进和长polyU 的结合。通过DNAzyme（红色）和与poly U互补的短RNA寡聚体A15（绿色）染色的共聚焦，证明了具有两个末端A10臂的 DNAzyme优先在液滴内部分配。计算DNA酶，底物和反应产物的分配系数(由荧光强度量化)，得到修饰后的DNA酶分配显著增强的结论。使用凝胶电泳，测定了加入燃料后DNA酶的释放，结果显示，在加入2 min之后，DNAzyme-A10几乎都结合在液滴中；反应30 min后，大部分结合的DNAzyme-A10（67%）被释放到上清液中，该值在 60 分钟后没有进一步增加。通过使用共聚焦显微镜分析样品，我们观察到在添加燃料 60 分钟后液滴尚未完全溶解。因此，燃料消耗和液滴溶解之间的明显时间延迟可能解释了未完全释放的原因。总之，通过燃料诱导的活性液滴的存在可以控制改性 DNAzyme 的分配。
3. DNA酶活性在液滴内受到抑制
图3，DNAzyme 活性在液滴内部受到抑制
两种DNAzyme以相同的速率在3小时内转化了 94% 的底物，表明A10分配臂的修饰不会影响酶活性。相反，液滴的存在在三小时后DNAzyme-A10 的产量急剧下降至仅为14%。对于未修饰的DNA酶，下降幅度为48%。在排除分配臂的设计对活性的影响后（即设计另外两组分配臂进行比较），作者比较了不同液滴成分存在下60分钟后的反应产物，发现肽或polyU的结合会进一步降低活性。当所有成分结合在一起时，与仅有肽和 polyU 相比，DNAzyme-A10 的活性进一步降低。
作者还研究了肽对DNAzyme的抑制机制，观察到肽的存在使转变峰变宽，最大值左移，也即肽的存在使DNAzyme展开变得不稳定。CD 光谱法观察到圆二色性信号的幅度降低，类似于 DNAzyme发夹结构的热展开。这些实验都表明肽的存在展开了DNA酶的构象，使其活性受到抑制。
4. 活性液滴在时空上调控DNA酶活性
图4，DNAzyme 活性在时空上由活性液滴控制
作者使用动力学模型预测燃料添加后随时间变化的活性肽浓度，发现40mM fuel可将活性肽浓度维持在阈值以上较长时间，且达到阈值后大多数DNAzyme-A10都会释放。通过 PAGE 跟踪产物形成发现，DNA酶的活性在添加燃料15分钟后急剧抑制，之后大部分恢复，而无修饰的DNA酶则不受影响。之所以没有完全恢复的活性的原因，作者证实是因为剩余液滴的持续存在产生的抑制作用。
最后，作者通过创建稳定的活性肽状态（间隔添加燃料）来持续抑制 DNAzyme 活性。同样，无修饰的酶不受影响，而DNAzme-A10 的活性再次没有完全恢复到添加燃料之前的初始状态。总而言之，可以暂时或长时间抑制DNA酶的活性。
【总结】
本文展示了活性液滴能调节DNAzyme的空间和时间活动。通过在DNAzyme上添加两个A10臂，增强了酶进入液滴的能力，并通过液滴的实现了对酶活性的调控。将DNAzyme与活性液滴结合可以在网络中上调或下调多个反应，模拟细胞内生物途径的复杂性，为合成生物学和人造细胞研究提供强大工具。
