Nat Biotechnol | 循环延伸扩增以提高质谱流式的检测灵敏度

大家好，今天为大家分享一篇2024年6月发表在Nature Biotechnology的题为“Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry”的文章。通讯作者是哈佛大学的尹鹏教授，主要研究方向为核酸分子的分子编程、DNA转化生物成像、DNA生物传感器等。

研究背景

质谱流式能够以单细胞分辨率定量测量多达50种蛋白质或蛋白质修饰情况，从而能够分析高度异质性样品中的复杂的细胞行为。然而，目前的质谱流式的灵敏度有限，难以检测低丰度蛋白。在这样的背景下，作者提出了一种信号扩增技术，称为循环延伸扩增（ACE）以提高质谱流式的检测灵敏度。

结果与讨论

1.                      通过热循环引物延伸实现的信号放大

图 1 ACE原理图及其应用

为了增加质谱流式分析的灵敏度，作者通过热循环延伸合成寡核苷酸产生金属探针杂交位点的重复，扩增抗体携带的金属离子的数量（图1A）。首先将靶向目的蛋白的抗体与DNA寡核苷酸链(Initiator)缀合，然后将缀合物与细胞混合。在22 °C的反应体系中加入可以与Initiator发生碱基互补配对的延伸链(Extender)，在Bst聚合酶的作用下，Initiator以Extender为模板进行链的延伸，延伸结束后升温至58 °C，使得Initiator-Extender双链发生变性，然后重复延伸与变性过程以不断延长Initiator。延伸结束后向体系中加入可以与Initiator互补配对的检测链(Detecter)，一条Detector上含有一个CNVK位点和一个金属元素，在Detecter与Initiator杂交之后，短暂暴露于紫外光激活CNVK光交联剂，在CNVK和Initiator上的胸腺嘧啶之间形成共价键以稳定双链结构，最后将带有标记的细胞进行质谱流式分析。ACE方法可用于标记悬浮质谱流式中放的靶标蛋白，以促进单细胞样品中的低丰度标记物定量（图1B），或可应用于成像质谱流式，以实现组织样本的高灵敏度空间分析（图1C）。

2.                      ACE可实现高灵敏度质谱流式分析

图 2用于质谱流式信号放大的ACE的验证和定量

为了探索ACE的特异性和扩增能力，作者将ACE应用于用编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒瞬时转染的人胚肾HEK293T细胞，瞬时转染产生GFP表达梯度。传统的二抗信号与ACE信号之间具有良好的相关性，表明ACE可以定量具有不同丰度的靶蛋白（图2A）。接下来，作者将表达GFP的细胞通过1-500次热循环进行ACE扩增，随后进行172Yb标记的检测器杂交。常规标记的159Tb二抗用于检测相同细胞中的抗GFP抗体，随后通过质谱流式进行分析，传统二抗信号与ACE信号之间在扩增过程中有良好的相关性，表明了ACE技术的特异性（图2B）。然后，作者根据二抗信号（x轴）将数据离散成十个等宽箱（图2C），并计算热循环中的箱中值。这揭示了ACE扩增在前100个循环（约2小时）中最有效，之后扩增效率随时间下降（图2D）。在整个500个循环的扩增过程中，保持了与最高信号（箱10中的中值水平）相关的信号比率的一致性，表明ACE扩增不会对质谱流式的信号引入偏差（图2E）。

应用分支扩增技术可以进一步提高ACE的灵敏度。在线性扩增之后，引入分支引物(A*-T-a*-b)并通过额外的热循环延伸分支引物产生更多的Detecter结合位点。与线性扩增相比，50个热循环的分支扩增产生了9倍的信号增强，应用二次分支方法产生了额外的五倍信号增加（图2F）。为了检查ACE的正交性，表达GFP的HEK293T细胞用与33个Initiator缀合的抗GFP抗体单独染色，然后将它们条形码化，合并在同一个试管进行ACE扩增和Detecter杂交（图2G）。通过质谱流式，仅观察到1.02%的平均串扰信号，表明大多数Initiator只能通过其相应的Extender和Detecter进行延伸和检测（图2H）。

3.                      低丰度转录因子的单细胞评估

图 3多重ACE分析了EMT和MET过程中不同转录因子表达水平诱导的分子调节

作者创建了含有32个参数ACE抗体组，以分析小鼠乳腺癌Py2T细胞EMT和反向MET过程中的信号分子、细胞表型标记和转录调节因子的表达变化。用4 ng/mL的TGFβ1处理上皮Py2T细胞14天以诱导间充质转化，然后在撤掉TGFβ1后14天的时间过程中细胞回到上皮状态，在EMT-MET过程中选取11个时间点通过结合ACE的质谱流式对细胞进行分析（图3A）。在UMAP图上，通过处理时间（图3B）或归一化后测量的标记物的丰度（图3C）对细胞进行颜色编码。表明ACE能够揭示EMT和MET转化过程中涉及低丰度转录因子Zeb1和Snail/Slug的分子特征。接着，作者通过拟时序分析的方法重建了EMT-MET过程（图3D）。ACE的应用将低丰度转录因子的定量与其他表型标记偶联,表明在CK14下调的细胞中，Zeb1表达的增加发生在EMT晚期且Zeb1的表达与Vimentin的表达呈正相关和E-cadherin的表达呈负相关（图3E）。双轴图显示在MET过程中五个的时间点的每个单细胞中Zeb1和Cyclin B1水平的丰度。虚线表示区分Zeb1和Cyclin B1表达情况的的门控策略（图3F）。箱线图结果表明Zeb1的表达抑制和Cyclin B1的表达增加是经历MET过程的细胞标志。

4.                      分析单个T淋巴细胞的信号网络动力学

图 4 ACE以单细胞分辨率实现全面的TCR信号网络分析

由于T淋巴细胞中磷酸化蛋白的丰度有限，在单细胞水平上系统分析TCR信号网络在技术上具有挑战性。作者在有ACE扩增（绿色框）和没有ACE扩增（蓝色框）的情况下测量了人Jurkat T细胞中与TCR信号网络相关的30个关键标志物，与未扩增相比，ACE增强了所测磷酸化位点的信号且平均扩增功率为17倍，对于AkT蛋白第308位上的苏氨酸位点磷酸化，其在线性ACE扩增后没有显示足够的信号，作者进行了一轮分支ACE以进一步将检测灵敏度提高15倍（图4A、C）。在1小时的TCR刺激时间过程中，定量了TCR网络中的关键信号节点，阴性对照p-SMAD2未显示用ACE测量的差异磷酸化水平（图4B）。最后，作者系统的构建了TCR信号网络中各种磷酸化蛋白信号关系的强度，绘制了TCR信号网络图（图4D）。

5.                      POF样品调节免疫信号网络反应

图 5 ACE表征由POF样品共培养物调节的T细胞信号网络动力学

由创伤或外科手术引起的损伤会诱导免疫抑制、T细胞增值受阻和一定程度的T细胞死亡，其中的分子机制还不是特别清楚。作者通过CD3/CD28抗体偶联磁珠法激活并分离得到了T细胞，通过将T细胞与患者术后引流液（POF）共培养，在细胞增殖试验中评估POF样品的T细胞抑制作用，通过30重ACE分析研究POF样品诱导的TCR信号调节（图5A）。结果表明，与仅培养基对照相比，POF1降低了T细胞增殖，表明该POF样品引起的高度免疫抑制环境，POF2抑制T细胞增殖的程度低于POF1，与中度免疫抑制一致，而POF3未表现出任何T细胞抑制作用（图5B）。接下来，作者使用ACE分析了TCR信号网络图谱中测量的磷酸化位点的信号动力学，并表征了峰值信号时间和总信号积分,与对照相比，POF1和POF2共处理导致TCR信号传导应答降低且更短暂，导致增殖信号的减少（图5C、D、E）。

6.                      IMC多参数空间分析的信号放大

图 6 ACE增强了基于IMC的多参数组织分析

肾组织大量的自发荧光限制了基于荧光成像的方法在肾组织切片中的应用。因此，作者结合ACE技术采用成像质谱流式检测蛋白标志的表达（图6A）。重叠同时测量的IMC通道以证明ACE在空间组织蛋白谱中的高特异性（图6B）。单细胞分割后，用UMAP进行降维分析，将测量的标记物的归一化丰度并对细胞进行颜色编码（图6C）。使用表型图算法，鉴定了18个细胞簇，并在UMAP图上进行了颜色编码，这些细胞的分类表明了六个主要肾组织区室（用虚线包围）中的表型异质性（图6D）。计算每个细胞簇的每个标记的平均表达水平，并显示为热图（图6E）。通过表型分类得到单个细胞的身份，以生成通过识别细胞类型显示的肾组织的伪图像（图6F）。

总结

针对质谱流式的局限性，本文提出了一种称为ACE的信号扩增技术，在验证了ACE技术的可行性之后，作者证明了ACE在低丰度蛋白质定量中的效用，以表征上皮向间充质转化以及间充质向上皮转化过程中的分子重编程。显示了ACE量化人T淋巴细胞中信号网络反应动力学的能力。并进一步介绍了ACE在基于成像质谱流式的多参数组织成像中的应用。 

文献来源：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02316-x