韩 达 课 题 组

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ANGEW | 在酿酒酵母菌中构建人工无膜细胞器以提高化学品生产

 

大家好,今天给大家分享一篇2023年发表在Angew上的文章,题目为“Engineered Artificial Membraneless Organelles in Saccharomyces cerevisiae to Enhance Chemical Production”

通讯作者:

本文的通讯作者是江南大学的刘立明教授,他的主要研究方向是开发合成生物学技术并应用于构建高效微生物细胞工厂,生产有机酸、氨基酸、材料化学品、酸性多糖等的研究。

研究背景:

微生物细胞工厂提供了一种从可再生和低成本碳资源中生产各种精细化学品的成本效益策略。这些工厂是绿色和可持续的,能够将有毒或挥发性中间体转化为增值产品。为了最大化微生物细胞工厂的效率,采取了一系列代谢策略,包括过表达所需代谢酶和降低竞争性内源途径酶的表达水平。然而,代谢途径中酶的高表达水平可能会导致代谢负担,从而降低目标化学品的合成能力。

本研究中,作者在酿酒酵母中重建了一种无膜细胞器(MLO),并开发了两种调控开关(MORS)工具来控制MLO的大小和刚性,通过该系统成功提升了甲醇的同化效率和正丁醇的产量,同时减少了有毒中间体的泄漏和CO2排放,为微生物细胞工厂生产高附加值化学品提供了新策略。

结果与讨论:

首先,作者在酿酒酵母中筛选和表征了不同内在无序蛋白(IDPs)形成MLO的能力,包括它们在细胞中的凝聚体形成、大小、饱和浓度、温度稳定性、对细胞生长的影响,以及体外相行为,A-IDPs相对其他几种无序蛋白展现出了较低的蛋白浓度下即可诱导相分离、较宽的温度稳定性范围以及对细胞生长影响较小的特点,最终被选定为构建无膜细胞器的蛋白。

1  筛选IDPs用以形成无膜细胞器

随后,作者通过改变A-IDPs的多肽长度来调MLO的大小,并评估了不同大小MLO对小分子渗透性及酶催化效率的影响。通过使用色氨酸作为底物,VioAVioB在细胞质中表达,而VioE被隔离在不同大小的MLO中。菌落颜色的深浅可以评估MLO对吲哚-3-丙酮酸渗透性的影响。实验结果显示,随着A-IDPs长度的增加,菌落颜色加深,表明小分子可以自由穿过MLO,并且MLO的大小增加导致PDV(前地氧紫罗红)的滴度增加。

2 改变A-IDPs变体的多肽长度调整MLO的大小

合成朊蛋白结构域(sPFD)富含疏水和极性氨基酸残基,能够使IDPs蛋白之间的相互作用更加有序。通过将sPFD A-IDPs 融合,研究了 sPFD MLO 刚性的影响。使用荧光恢复后光漂白技术测量了 sPFDA-IDPs sPFD-A-IDPs 液滴内部蛋白动态性的变化。在添加 1,6-己二醇处理下,sPFD-GFPA-IDPs-GFP sPFD-A-IDPs-GFP 在酵母细胞中的形成和稳定性,说明了 sPFD 的存在提高了 MLO 的稳定性。通过融合不同的结构域到 ADE1 酶上,来评估 MLO 刚性增加对代谢反应的抑制效果。实验结果表明,sPFD 的融合导致红色细胞数量的增加,这表明刚性的增加可能抑制了 Ade1 酶的活性。

3 融合结构域蛋白功能化MLO刚性

为了有效地控制MLO的大小和刚性,开发了一种由蛋白质组装单元和蓝光激活单元组成的无膜细胞器调节开关(MORS)。首先,为了构建蛋白质组装单元,进行准确有效的蛋白质-蛋白质相互作用,选择了正交螺旋(CC)肽对 (P1-P2, P3-P4)。通过共表达荧光蛋白与CC肽对,利用荧光蛋白在细胞内的特定定位,证实了目标蛋白能够在MLO中聚集。此外,荧光蛋白的细胞定位也验证了所选用CC肽对的正交性,从而实现了对MLO大小的精确调控。


4 通过正交螺旋CC肽对将目标蛋白招募到MLO

蓝光激活(BLA)单元由合成转录激活子(LexAVVD-VP16-NLS)、蓝光诱导启动子LexO-CYC1(包含8lexa结合序列拷贝(8×LexO)CYC1核心启动子)mKate2报告基因组成。BLA的工作原理是,在蓝光照射下,合成的转录激活子与蓝光诱导启动子结合,通过募集RNA聚合酶诱导mKate2表达。通过结合蛋白组装单元和蓝光激活单元构建了两种调节开关(MORS)工具来调控MLO的大小和刚性。

5 构建无膜细胞器调控开关(MORS

接下来,作者探讨了是否有可能通过控制人工MLO的大小来提高甲醇同化率。为了构建以甲醇为唯一碳源的酵母菌株,将单磷酸核酮糖途径(RuMP)相关酶Mdh(甲醇脱氢酶)Hps(己糖磷酸合成酶)Phi(6-磷酸-3-己糖异构酶)工程修饰到酿酒酵母BY4741上,得到菌株ZP03-F1。随后,通过MORS调控系统操纵菌株(甲醇同化路径)中甲醇同化无膜细胞器的尺寸,降低了甲醛的泄露,使得甲醇消耗量提高了162%

6 改善MLO的大小来增强甲醇同化

乙酰辅酶A是多种工业相关化合物的关键前体,通常通过丙酮酸(Pyr)脱羧产生。为了避免乙酰辅酶A生产过程中的碳损失,酿酒酵母通过过表达spkPta酶,构建了糖酵解替代高产碳循环(NOG)途径,产生菌株ZP04-R1。将6-磷酸果糖激酶(PFK1/2) 和磷酸水解酶(GPP1)敲低,碳通量从氧化糖酵解(EMP)转移到非氧化糖酵解(NOG),产生菌株ZP04-R2,其乙酰辅酶A供应增加,碳损失减少。在酵母菌株中引入MORS调控系统调节糖酵解无膜细胞器的刚性,使乙酰辅酶A的合成从氧化性糖酵解切换为非氧化性糖酵解,最终使二氧化碳的释放量减少了35%,正丁醇的产率增加了20%

7 改变MLO的刚性减少n-丁醇生产过程中的CO2排放

 

总结:

文章报道了A-IDPs在酿酒酵母中成功构建了一种新型MLO,为微生物细胞内代谢途径提供了新的调控平台。通过设计MORS系统,实现了对MLO大小和刚性的精确调控,进而改变了代谢途径,减少了有毒中间体的泄漏,并通过从氧化糖酵解到非氧化糖酵解的转换,有效提升了甲醇同化效率和正丁醇产量,同时降低了CO2排放。本研究中开发的MORS,为微生物细胞内环境的精细调控提供了新的策略,展示了合成生物学在提高工业生物技术中化学品生产效率的巨大潜力。

文献信息

Zhou P, Liu H, Meng X, Zuo H, Qi M, Guo L, Gao C, Song W, Wu J, Chen X, Chen W, Liu L. Engineered Artificial Membraneless Organelles in Saccharomyces cerevisiae To Enhance Chemical Production. Angew Chem Int Ed Engl. 2023 Mar 27;62(14):e202215778.

2024年9月24日 09:56
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