Nature Nanotechnology丨自主展示细胞毒性配体模式的DNA折纸开关

大家好，今天跟大家分享的文献是发表在nature nanotechnology上的名为自主展示细胞毒性配体模式的DNA折纸开关的文章，该文章是由卡罗林斯卡医学院的Björn Högberg教授发表的。

作者介绍

首先来介绍一下本文的作者Björn Högberg教授。他们实验室主要有如下三个研究方向：1、构建细胞生物学的分子工具。通过使用DNA折纸，就能在纳米尺度上精确构建不同的分子模式，从而探索距离对许多细胞机制的影响。2、发展DNA自组装技术。通过提高折纸本身的性能，使其能够更好地应用于分子生物学场景。3、通过序列本身成像。基于测序的技术，无需显微镜即可对细胞内的小分子和蛋白精确成像。我们熟悉的DNA纳米梳子的工作（图1），也是来自于Björn Högberg课题组。

图1 Nature Nanotechnology 16, p. 85–95 (2020)

文章背景

1、肿瘤靶向治疗策略缺乏理想的肿瘤特异性膜受体。肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族（TNFRSF）在哺乳动物生理学中起着至关重要的作用，但是TNFRSF受体在人类健康组织中也会表达。

2、TNFRSF受体之一的死亡受体（death receptor，DR）在膜上的聚集可以诱导细胞凋亡。作者已经通过在扁平片状的DNA折纸上精确修饰六边形分布的死亡受体5（DR5）的配体（图2），成功实现了用DNA origami驱动DR5的聚集，从而诱导细胞凋亡。然而这种配体修饰模式也会与健康的细胞相互作用，如果应用在体内，会引起on-target, off-tumour的风险，包括神经毒性、易感性和免疫障碍。

3、固体肿瘤细胞过高地消耗氧气和其他营养物质，引起低氧压和厌氧糖酵解，最终导致酸度增加。为了解决体内使用TNFRSF配体的潜在副作用，作者开发了一种pH敏感的三维DNA折纸开关，可以感知固体肿瘤的高酸度。

图2 之前关于origami上DR5受体诱导细胞凋亡的工作

结构设计

研究者构建了一个由24 nm头部和15 nm尾部的具有深度为14 nm空腔的DNA折纸，并设计了可以和迷你支架形成三螺旋核酸的寡核苷酸链（TFO）。在较低的pH值下，TFO可以沿着双链DNA缠绕，形成三链DNA（tsDNA），这发生在嘌呤的Watson–Crick 和 Hoogsteen同时配对的情况下。通过控制AT含量，可以精细调节tsDNA的触发pH值。利用生理环境（pH 7.4）和TME（pH 6.5-6.8）之间酸碱性的差异，实现了在酸性TME环境中折叠形成三螺旋结构，使配体肽暴露在折纸外；而在生理环境中不能形成三螺旋结构，使配体肽隐藏在空腔内的DNA折纸机器人开关。在正常情况下隐藏六个配体，在较高酸度（pH 6.5）下以直径10纳米的六边形图案展示，能够有效地聚集DRs并触发人类乳腺癌细胞的凋亡，而在中性条件（pH 7.4）下则保持惰性。

图3 机器人开关原理图

实验结果

首先作者先对设计的结构进行分子动力学模拟，结果显示大部分情况下配体被隐藏在折纸腔内，仅在极少数情况下配体会短暂地露出，从而确保在正常生理条件下装置的非细胞毒性。研究结果表明，该装置可以在酸性环境下（如肿瘤微环境）有效展示配体并驱动细胞凋亡，同时在中性环境下保持无害。

图4 分子动力学模拟

随后，作者用冷冻电镜对合成的结构进行了表征。为了使结构能够更加稳定，作者使用UV对origami进行交联，在staple链的末端和交叉处修饰了胸苷，为环丁烷嘧啶二聚体键创建了位点。通过紫外线（UV）交联方法稳定DNA折纸结构，在短链核苷酸末端和交叉点添加了胸腺嘧啶（Ts）。透射电子显微镜（TEM）显示，交联前后的样品均呈现均匀颗粒。冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据证实交联折纸的结构一致性。稳定性测试表明，约30%的交联折纸在48小时内保持完整。为了进一步提高origami的体内循环时间，作者在该结构的周围修饰了一圈PEG保护它。PEG化后的折纸在凝胶上的迁移速度较慢，表明PEG化成功。包含六个肽的折纸开关被称为pH_O6p。其聚乙二醇化（PEG修饰）版本被称为PEG_pH_O6p。

图5 折纸的表征和结构优化

接下来作者对PEG_pH_O6p的pH响应效果做了测试。通过在TFO的两端一端修饰Cy3，另一端修饰Cy5，并通过两个荧光基团之间的FRET反应测量了tsDNA在不同pH下的开关状态。实验显示，在pH低于6.8时，tsDNA处于开启状态，在pH 7.4时处于关闭状态，并且这个过程反复可逆，显示了对肿瘤微环境酸性的响应。此外，将TRAIL模拟肽配体连接到TFO，并通过SPR测量验证了其在不同pH下对DR5的亲和力。荧光信号的定量分析证实了设计的迷你支架数量与配体数量之间的一致性。

图6 PEG_pH_O6p pH敏感性的体外验证

在体外验证了这个体系的成功使用后，作者进行了细胞实验。作者做之前那个修饰六边形配体的折纸工作时发现，用这种间距10nm以下的六边形配体治疗，DRS会在凋亡细胞膜表面聚集，作者就基于这个原理对PEG_pH_O6p对细胞作用的效果进行了验证。通过流式细胞术验证了在pH 6.5条件下，PEG_pH_O6p能显著增加SK-BR-3细胞中Cy5信号，表明肽配体能在低pH条件下从折纸表面呈现给细胞。进一步共聚焦实验显示，此时PEG_pH_O6p能有效诱导DR5在细胞膜上的聚集，并导致细胞出现典型的凋亡收缩形态。定量分析显示，在低pH条件下，细胞内PEG_pH_O6p的存在量显著增加，进一步证实了肿瘤微环境的酸性有利于折纸表面配体图案的表达和DR5的结合。

图7 细胞实验

随后作者对这个设计的细胞毒性进行了测试。将PEG_pH_O6p处理到pH 6.5条件下，能显著降低SK-BR-3癌细胞的存活率，且可诱导细胞进入凋亡状态。在pH 7.4条件下，PEG_pH_O6p对细胞存活率无显著影响。进一步研究证明，PEG_pH_O6p能够在肿瘤微环境模拟条件下特异性地展示配体图案，导致DR5聚集并诱导细胞凋亡。考虑到体内治疗时，折纸会在TME中积累之前与循环免疫细胞或健康器官和组织中的细胞相互作用，并且DR5在几乎所有人类细胞中都表达，作者对PEG_pH_O6p在癌细胞、人类T淋巴细胞、胚胎肾细胞，脑微血管内皮细胞中的毒性进行了测试。安全性测试显示，在pH 7.4条件下，PEG_pH_O6p对正常人类细胞的影响与阴性对照类似，表明其在接触肿瘤前具有良好的生物安全性。

图8 细胞毒性测试

最后作者把这套体系在小鼠体内进行了验证。作者通过原位注射或尾静脉注射在裸鼠SK-BR-3移植瘤模型中测试了折纸开关。静脉注射后，PEG_pH_O6p的显性信号在膀胱中累积，1小时后达到最大值，此后排出，在肝脏中也存在一些累积。作者没有观察到实体肿瘤中选择性累积的现象，作者认为这是因为折纸中缺乏靶向基序。肿瘤内注射显示折纸信号主要留在肿瘤内超过8小时，肾脏清除也很明显，2小时后膀胱有最大信号，但肝脏中没有强烈的积累。治疗中，PEG_pH_O6p显著抑制了肿瘤生长，抑瘤效果约为70%，并且在pH敏感性上表现出显著的抗肿瘤活性，未观察到对正常细胞的显著影响。

图9 小鼠体内实验

总结

      这份工作通过一个origami PH响应开关的设计，以及使用UV交联、PEG修饰的方法，较好的解决了DNA折纸进入体内后易降解，高副作用的弊端，提高了肿瘤治疗效果，为DNA折纸进入体内发挥作用提供了好的思路。