JACS | 开发一种伪细胞系统以量化决定细胞中G-四链体功能的特定相互作用
大家好，今天给大家分享的是2024年3月发表在J. Am. Chem. Soc. 上的一篇文章，题目为Development of a Pseudocellular System to Quantify Specific Interactions Determining the G‑Quadruplex Function in Cells.
作者介绍
本文的通讯作者是日本甲南大学前沿分子生物工程研究所Naoki Sugimoto教授，研究方向包括非典型核酸结构在调节生物反应中的作用、分子环境对核酸结构的影响、高压下的核酸行为分析、核酸结合蛋白的非特异性分析。
背景介绍
活细胞中核酸的结构和稳定性对生理功能至关重要。典型的核酸结构是双螺旋结构，也存在如G-四链体(G4)等一些非典型核酸结构，是复制、转录、翻译等基本生物过程的关键调控因素。此外，活细胞包含各种细胞器、细胞骨架、可溶性和不可溶性生物分子，导致了拥挤和复杂的细胞内环境，这被称为分子拥挤效应，会影响核酸的结构与功能。
当细胞内环境发生显著变化，如细胞内溶质水平波动，离子浓度改变等，可能通过影响G4结构的形成和解链来调节基因表达。目前用于研究核酸结构的体系有细胞内、体外标准稀溶液、体外模拟拥挤环境溶液，其中最常用的是体外稀溶液体系。然而，由于细胞内过程的复杂性，通过体外实验装置分析相关因素，如核酸-离子相互作用，是极具挑战性的。因此需要建立一个简单的环境系统来评价单个因素对核酸结构和功能的影响。
作者团队开发了一种新的系统，称为“highlighting the environment inside of the cell”(SHELL）。与其他方法相比，SHELL具有两个突出的优势：(1)允许对所研究的特定因素进行精确的定量分析；(2)允许利用任何细胞作为模型系统，从而促进研究各种细胞环境对目标分子的影响。
图1 细胞内、体外(标准溶液和模拟拥挤环境溶液)和SHELL环境的比较
实验结果：
1. SHELL的构建与表征
作者采用扩展免疫染色法制SHELL。将细胞放置在玻璃基质上培养，并浸泡在甲醇溶液中(图2i, ii)。甲醇由于体积小，可以渗透细胞膜，使生物分子之间的静电斥力增大，导致生物分子溶解度降低和随后的生物分子沉积。一些存在于细胞膜上的蛋白质也被沉积，导致部分胞内溶液的释放。在生物分子充分沉积一段时间后，向细胞中加入1%的非离子表面活性剂在细胞膜上制造裂缝，使未被甲醇沉积的生物分子，如离子和代谢物等小分子，也通过细胞膜的缝隙泄漏，而较大的沉积生物分子仍然被限制在细胞内。随后用缓冲溶液洗涤细胞，通过这些步骤制备的细胞被命名为SHELL(图2iv)。
图2 SHELL的制备示意图
随后作者对SHELL进行了表征。首先是用荧光标记的DNA探针F-ssDNA(单链17 nt DNA)验证SHELL中小分子的泄漏。利用荧光显微镜对细胞进行成像(图3b)，揭示了F-ssDNA在细胞内的定位(图3b红色部分)。在加入甲醇(图3c, d)和非离子表面活性剂(图3e, f)处理后，F-ssDNA可以立即从细胞中泄漏出来。2D和3D图像描述了细胞骨架和负责在SHELL内分子拥挤的蛋白质的保存(图3h)。随后，将F-ssDNA引入SHELL以确认靶分子的摄取(图3i−n)。
图3 SHELL的表征
2. 胞内环境对G-四链体拓扑结构的影响
作者设计了能形成不同G4结构的t1、t2和t3序列（图5c），并在序列两端分别加可以发生荧光共振转移的荧光基团(命名为F-t1、F-t2、F-t3)，通过测定的FRET熔化曲线探究所形成G4结构的热稳定性(图4a)。发现F-t1在稀释和拥挤溶液中的熔化温度(Tm)分别为41.1°C和47.2°C。而在基于HeLa、MCF-7和MDA-MD-231细胞的SHELL中，F-t1的Tm值分别为44.8°C、51.6°C和46.3°C，均高于体外溶液(表1)，表明环境对G4结构热稳定性的影响因细胞类型而异，体外和SHELL的拥挤环境有助于增强G4的热稳定性。
此外，作者还探究了不同体系下K+浓度变化对G4结构的影响。ln Kobs值与KCl浓度的自然对数(ln)呈线性相关, ln Kobs vs ln[K+]的斜率值对应于−ΔnK+的值，即G4形成过程中K+绑定的数量，ln Kobs vs ln[K+]的斜率值越大说明由于K+浓度降低而引起的G4结构失稳更严重。ln Kobs vs ln[K+]的斜率值在体外拥挤溶液中最大，体外稀释溶液中其次，SHELL中最小(图4b)。说明拥挤环境有助于缓解K+浓度降低而引起的G4结构失稳，在SHELL中这种缓解作用更显著，并且缓解的程度取决于细胞类型。
图4 胞内环境对G4(F-t1)结构稳定性的影响
表1 体外和SHELL内测定G4(F-t1)形成的热力学参数
3. 含G4序列的模板DNA与在体外、SHELL和活细胞条件下转录效率的比较
为了分析分子环境对带不同G4序列的模板DNA转录产物的影响，作者设计了带有T1 - T3序列的质粒以及一个不含任何结构的线性序列(命名为linear)的质粒进行转录实验（图5c），并使用qRT-PCR测定转录效率(TE)。发现在体外转录中，拥挤溶液与稀溶液含G4模板的TE值的变化趋势不同（图5d, e），表明G4稳定性或RNA聚合酶II活性在稀释溶液和拥挤溶液之间存在差异。而在SHELL中进行转录反应，发现TE值的变化趋势不同于稀溶液和分子拥挤溶液，而是与在活细胞中观察到的TE值的变化趋势非常相似（图5f, g），这表明SHELL中G4的稳定性与活细胞中的非常相似。
图5 G4在体外、SHELL和活细胞条件下对转录效率影响的比较
总结
作者开发设计了一个新颖的、可以定量分析细胞内的生物分子效应的模型：SHELL，并表征了该模型的可用性以及与活细胞环境的相似性。利用SHELL探究了G4稳定性和离子结合在不同癌细胞类型之间的差异，分析了G4对转录的影响，发现SHELL与活细胞中的转录效率具有可比性，这与在稀溶液和体外分子拥挤环境中观察到的明显不同的TEs形成对比。这篇工作为定量分析可为活细胞中发生的反应提供重要的基础和见解。
Hisae Tateishi-Karimata, Keiko Kawauchi, Shuntaro Takahashi, and Naoki Sugimoto, J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.3c11160
