JACS | 生物正交用于细胞间相互作用的促进和检测

今天分享一篇JACS，题目为Promotion and Detection of Cell-Cell interactions through a Bioorthogonal Approach。通讯作者来自香港中文大学化学系的吴基陪教授，研究方向是功能性染料的化学研究，尤其是酞菁和硼二吡咯烷衍生物，和它们的合成、超分子化学、生物共轭、生物正交化学以及在光动力疗法、光热疗法、生物成像、荧光传感、逻辑器件和可再生能源生产中的应用。

【研究背景】

细胞−细胞间的相互作用在调节多细胞生物体中的各种生物学过程中起着至关重要的作用，细胞-细胞间可以通过膜结合、间隙结、隧道纳米管、细胞间附着力、直接接触等方式构建相互的联系，来调控生物学过程。研究细胞间相互作用可以理解基本生物过程、疾病机制研究（癌症、自身免疫疾病、神经退行性疾病）、开发新疗法（免疫疗法、靶向治疗）、药物开发与筛选（药物靶点发现、筛选、毒性评估）。

在生物系统中，细胞通常在迁移过程中随机接触。然而，这种短暂的接触可能不会启动它们之间的任何交流，也不会形成细胞聚集体。事实上，细胞间的相互作用通常是由每个细胞伙伴表面的粘附蛋白引起的。虽然这些成分的超分子相互作用是自发发生的，而且相对较强，但它们可能无法在生物环境中保持稳定的细胞聚集，尤其是在体内，因为在这种环境下，它们很容易被蛋白酶、DNA酶和RNA 酶等酶降解。

近年来，生物正交化学已成为调节细胞-细胞相互作用的一种简单而通用的工具。通过点击反应后，细胞可以共价连接。此外，可以将小的生物正交官能团以高密度引入细胞表面，从而在细胞之间产生强大的多价粘附。与上述涉及互补生物分子的方法相比，这种方法可以降低偶联试剂的合成和储存成本。

本文报道了一种简单、通用和通用的方法来促进和检测细胞间的相互作用，利用反电子需求的Diels - Alder ( iEDDA )反应将细胞共价连接，并显著激活探针的荧光发射以实现相互作用的可视化。

【结果与讨论】

使用马来酰亚胺修饰的四嗪笼状二吡咯烷硼（BODIPY）荧光团和马来酰亚胺取代的 BCN，通过马来酰亚胺-巯基共轭分别修饰巨噬细胞和癌细胞的质膜表面。经过表面修饰后，这两种细胞很容易通过修饰细胞表面的四嗪和 BCN 分子的 iEDDA 反应连接起来。此外，点击反应还能破坏四嗪基团（四嗪基团可以通过通键能量转移有效淬灭 BODIPY 核心的荧光），从而恢复荧光发射。

图1促进和检测细胞-细胞相互作用的生物正交策略的工作原理

分子设计与合成

为了提高点击反应的灵活性，在两个官能团之间插入了一个亲水性多肽序列作为间隔物。

马来酰亚胺取代的BCN（Mal-BCN）的合成路线

马来酰亚胺修饰的四嗪笼BODIPY（Mal-TzBDP）的合成路线

BCNs 对 Mal-TzBDP 的生物正交活化。

首先通过荧光光谱研究了 Mal-TzBDP 的 BCN 响应特性和液相色谱-质谱法（LCMS）分析了 PBS 中 Mal-TzBDP 和 BCN-OH的混合物。证明 Mal-TzBDP 与 BCN-OH 之间发生了 iEDDA 反应。随后，研究扩展到细胞水平，使用 HT29 人结肠直肠腺癌细胞作为第一个细胞系。将细胞与 Mal-TzBDP（4 μM）孵育 30 分钟，然后与 BCN-OH（10 μM）孵育不同时间段。随着孵育时间的增加，荧光强度增加。结果表明，生物正交活化也可以在细胞内进行。值得注意的是，荧光主要出现在细胞质中，这表明 Mal-TzBDP 和 BCN- OH 都内化到了细胞中，作者认为这可能是因为原生细胞膜上缺乏巯基基团所导致的。

图2 BCN 生物正交激活 Mal-TzBDP

为了将活化限制在细胞表面，首先用 Mal-TzBDP 修饰了 HT29 和 HeLa 人宫颈癌细胞。作者用 TCEP处理这两种细胞株 30 分钟，然后用 MalTzBDP孵育 30 分钟。随后将细胞置于有或没有 BCN-OH存在的培养液中培养 30 分钟。结果发现，细胞内的荧光强度在与 BCN-OH 进一步孵育后显著增加，两种细胞系的荧光都出现在细胞膜和细胞质上。后一种观察结果表明，即使经过 TCEP 处理，部分 Mal-TzBDP 仍可被内化。然而，细胞膜上显著的荧光表明，这种处理可能会促进 Mal-TzBDP 在细胞表面的锚定，原因可能是游离巯基基团的数量增加了。

为了确保在细胞膜上激活，将GE11 多肽与 BCN 共轭，得到的共轭物被标记为 GE11-BCN，用作激活剂。 （GE11 多肽是表皮生长因子受体（EGFR）的一个已被证实的靶向基团，它能与 EGFR 阳性癌细胞表面过度表达的该受体特异性结合，从而使共轭物在通过受体介导的内吞作用内化前不久停留在细胞膜上）。如图3a,b所示,未经 GE11-BCN 后处理的细胞几乎观察不到荧光，而经 GE11-BCN 后处理的细胞膜上观察到强烈的绿色荧光信号。且随着培养时间的延长，荧光强度明显增加。因此，使用膜结合型 GE11-BCN 可以将生物正交活化限制在细胞膜上，使内化的 Mal-TzBDP 保持完整。随后作者研究了Mal-BCN 是否也能固定在细胞表面并用于活化，同时还对原生或未修饰的 A431 细胞进行了比较研究。共聚焦显微镜和流式细胞仪显示，用 Mal-BCN 修饰的细胞显示出强烈的荧光信号，其强度几乎是原生细胞的 8 倍（图 3f-h）。值得注意的是，在这种情况下，荧光几乎只出现在细胞膜上。这一观察结果表明 MalBCN 无法内化。

图3 共聚焦、流式细胞仪表征BCN 在不同细胞系中生物正交激活Mal-TzBDP

接下来作者利用上述方法来诱导和监测细胞-细胞相互作用。对 A431 和 RAW 264.7 细胞分别用 CellTracker Red CMTPX 染料和 CellTrace Violet 进行染色。随后将原生 A431 和 RAW 264.7* （1：1）、A431 *和 RAW 264.7*（1：1）、A431 *和 RAW 264.7*（1：3）三组细胞共培养，

如图 4所示， A431* 和 RAW 264.7*（1：1）、 A431* 和 RAW 264.7*（1：3）两组细胞在Q2象限形成了细胞聚集，同时通过流式细胞术测量了活化 Mal-TzBDP 的荧光强度，结果表明，A431* 和 RAW 264.7*细胞存在诱导组装，这种生物正交方法能在短时间内促进 RAW 264.7* 细胞与不同癌细胞之间的相互作用。

图4对不同的细胞组合进行流式细胞分析

为了进一步证明两种细胞的生物正交偶联，还研究了随时间变化的连接效率。同样，将原生 A431 或 A431*（经 40 μM Mal-BCN 处理）细胞与 RAW 264.7* 细胞按 1:1 或 1:3 的比例共培养不同时间段（0 至 30 分钟），然后进行流式细胞分析（图 5）。结果表明，荧光强度随着时间的增加而增强，证明了细胞-细胞连接效率和活化 MalTzBDP 的荧光强度成正比，因此后者是 iEDDA 促进细胞-细胞相互作用的定量指标。

图5两种细胞的生物正交偶联随时间变化的连接效率分析

最后作者通过共聚焦显微镜进一步检查两种细胞之间的结合相互作用，并对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞进行了研究。如图6、7所示，巨噬细胞与癌细胞之间形成了共价连接，这些结果表明，生物正交触发的细胞粘附可以促进巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。细胞表面生物正交组分的存在促进和延长了两种细胞之间的相互作用，并且通过预先激活巨噬细胞，可以极大地促进吞噬过程。

图6两种细胞之间结合的相互作用

图7 巨噬细胞吞噬肿瘤细胞

【总结】

设计并合成了基于四嗪的BODIPY荧光基团和BCN。这两种偶联物可用于通过Mal-thiol偶联有效地修饰巨噬细胞（RAW 264.7）和癌症（HT29、HeLa和A431）细胞的表面。

通过iEDDA反应生物正交偶联激活四嗪笼中的 BODIPY 以恢复其荧光发射，用来检测细胞间相互作用。（强度与细胞的连接效率成正比）

使用流式细胞术和共聚焦显微镜已经证明了细胞-细胞相互作用的促进和检测。这项研究表明，这种生物正交开启策略可以促进和促进细胞-细胞相互作用的检测。并在基于巨噬细胞的免疫治疗中具有潜在的应用价值。