Nat Bio Eng | 融合唾液酸酶到双特异性T细胞衔接器用于肿瘤细胞的去唾液酸化与溶解
大家好，今天分享的文献是发表在Nature Biomedical Engineering上，题为“Targeted desialylation and cytolysis of tumour cells by fusing a sialidase to a bispecific T-cell engager”通讯作者是斯克利普斯研究所研究员Peng Wu。其研究方向：将合成化学与糖生物学相结合，探索控制对癌症和人类病原体的免疫反应的细胞和分子机制。
【研究背景】
癌症免疫治疗是通过激活患者自身的免疫系统来控制肿瘤。双特异性T细胞连接器（BiTEs）是一种现成的药物，它可以招募内源性T细胞，能够以一种独立于主要组织相容性复合体1的方式根除肿瘤细胞。然而，与大多数基于T细胞的治疗方法一样，BiTEs在实体肿瘤治疗中的前景尚未实现。肿瘤细胞通常表达一种大量唾液化的糖萼作为一个物理屏障，以防止有效的T细胞浸润到肿瘤。先前的研究表明，选择性抑制肿瘤细胞表面的唾液化通过肿瘤内调节非自然唾液酸，增强T细胞介导的癌细胞杀伤。我们报道了BiTE唾液酸酶融合蛋白，该蛋白可以去除BiTE分子参与的T细胞-肿瘤细胞界面上的唾液酸聚糖，导致T细胞依赖的肿瘤细胞溶解的增加。在体外，增强的肿瘤细胞溶解由于BiTE分子诱导的更强的IS形成，不依赖于抑制性唾液苷-siglec信号，此外，在一些血液和实体肿瘤中发现，BiTE-唾液酸酶融合蛋白在控制肿瘤增殖和延长体内生存方面表现出更优越的疗效。
【结果与讨论】
- 肿瘤细胞表面的唾液酸去除增强了双特异性T细胞引导杀伤剂（BiTE）介导的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
首先构建一个BiTE(4D5 BiTE)，由HER2靶向scFv 4D5和CD3构成。然后，我们用唾液酸酶处理HER2阳性的SK-BR-3人乳腺癌细胞。这种唾液酸酶已知能高效水解α2-3-和α2-6连接的唾液酸苷。
用黑蓝凝集素（SNA）和凝集素II（MAL II）染色，分别优先结合半乳糖末端α2-3和α2-3连接的唾液酸，与半乳糖结合花生凝集素（PNA）证实了细胞表面去唾液酸化（图1a）。接下来，将SK-BR-3细胞与4D5 BiTE和来自健康人的外周血单核细胞（PBMCs）孵育。与单独使用4D5 BiTE相比，唾液酸酶的加入显著增强了4D5 BiTE诱导的肿瘤细胞裂解（图1b）。当使用另一种表达HER2的乳腺癌细胞系MCF-7作为靶细胞，当4D5 BiTE治疗与唾液酸化抑制剂P-3Fax-Neu5Ac联合使用时，也观察到类似的趋势（图1b，c）。此外，唾液酸酶的加入也显著增强了干扰素-γ（IFNγ）的分泌和T细胞的活化（图1e，f）
图1: 去除唾液酸可增强BiTE诱导的t细胞毒性和活化
- 肿瘤细胞的去唾液酸化促进了T细胞与肿瘤细胞之间更强的BiTE介导的免疫突触（IS）的形成。
首先研究唾液酸苷-siglec抑制途径是否参与其中。发现健康供体PBMCs的CD3+ T细胞表达的Siglec7和Siglec9水平与CD3−细胞相比可以忽略不计（图2a，b）。用4D5 BiTE加入Siglec-9阻断抗体。阻断Siglec-9信号并没有增加细胞毒性，表明Siglec-9在BiTE诱导的体外靶细胞杀伤中的作用可以忽略不计（图2c）。一些研究已经报道了当T细胞参与分子与CD28招募部分结合时的治疗优势。然而，即使添加了高浓度的CTLA-4，BiTE组和BiTE+唾液酸酶组均未检测到增强的细胞溶解的变化（图2d）。
为了检测去唾液酸化是否能增强IS的形成，通过F-actin和CD3ζ染色，如图2f所示，我们在T细胞和去唾液基化的SK-BR-3细胞之间观察到更大的BiTE诱导的IS形成。与未处理的肿瘤细胞和T细胞形成的IS相比，唾液酸酶处理的肿瘤细胞和T细胞形成的IS显示出明显更强的CD3积累和更大的IS接触面积（图2g，h）。发现抗CD2阻断抗体抑制相互作用部分逆转了添加唾液酸酶后的细胞毒性增强，表明去唾液酸化通过促进靶肿瘤细胞和T细胞之间更紧密的相互作用。（图2e）。
图2: 去唾液酸化促进更强的BiTE介导的IS形成，而不是抑制抑制性Siglec信号传导
- HER2靶向的BiTE-唾液酸酶融合蛋白选择性地去唾液酸化HER2阳性细胞。
通过构建融合蛋白将唾液酸酶的活性限制在靶细胞上可以增强肿瘤细胞的杀伤，同时限制免疫系统中细胞的非特异性去唾液酸化。将唾液酸酶分别引入4D5 BiTE的N端（4D5BiTE）或C端（图3a）。分别用唾液酸酶-4D5BiTE或4D5BiTE-唾液酸酶处理SK-BR-3 (HER2+++) 和SKOV-3 (HER2+++)细胞。两种融合蛋白都导致了去唾液酸化，表现为SNA和MAL II染色减少，伴随着PNA染色增加（图3b）。融合蛋白的去唾液酸化效率明显高于单独的唾液酸酶。当使用任何一种唾液酸酶融合蛋白时，MAL II染色相关的平均荧光强度（MFI）下降到背景水平，同时PNA染色增加，c端唾液酸酶融合（4D5BiTE-唾液酸酶）具有更高的去唾液酸化效率（图3c）。
4D5BiTE-唾液酸酶选择性地去催化HER2阳性的SKOV-3细胞，而保留HER2阴性的MDA-MB-468细胞（图3d）。
图3: HER2阳性细胞的4D5BiTE-唾液酸酶融合蛋白的构建
- HER2靶向的BiTE-唾液酸酶融合蛋白在体外引发了比原始BiTE更强的T细胞依赖性细胞毒性和T细胞效应功能。
两种融合蛋白诱导SK-BR-3和SKOV-3细胞依赖的细胞溶解水平高于4D5 BiTE（图4a，b）。在剂量反应试验中，分别测定4D5BiTE-唾液酸酶比4D5BiTE低10倍和3倍（图4c，d）。通过T细胞活化标志物CD25和CD69以及脱颗粒标志物CD107a的表达来测量，4D5BiTE-唾液酸酶诱导了最高水平的T细胞活化（图4e-g）。在4D5BiTE-唾液酸酶处理的T细胞中也观察到最强的细胞因子释放，包括白细胞介素IL-2、IFNγ和肿瘤坏死因子TNF。由于其诱导T细胞依赖的肿瘤细胞杀伤能力，我们选择4D5BiTE-唾液酸酶进行进一步研究。我们首先评估了4D5BiTE-唾液酸酶介导的对不同细胞表面HER2表达水平的细胞系的杀伤作用： SK-BR-3（HER2+++）、SKOV-3（HER2+++）、MDA-MB-231（HER2+）、MDA-MB-435（HER2+）和MDA-MB-468（HER2−）。与4nMBiTE相比，4D5BiTE-唾液酸酶强烈增强了低水平HER2（HER2+）细胞的杀伤。与HER2高（HER2+++）细胞（SK-BR-3和SKOV-3细胞）相比，杀伤率达到了更大的增加（94-203%对22-24%）(图4k）。值得注意的是，4D5BiTE-唾液酸酶没有触发HER2阴性MDA-MB-468细胞或表达丰富唾液多糖的小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤，表明HER2阳性细胞的特异性(图4l）。
因此，我们对确定效应T细胞功能的改善是否由于唾液酸酶治疗诱导的转录改变。我们对4D5BiTE-唾液酸酶或4D5处理的CD3+ T细胞进行了全转录组RNA测序分析。4D5BiTE-唾液酸酶和4D5BiTE处理的T细胞的mRNA的火山图比较显示：在4D5唾液酸酶处理的T细胞中，包括细胞溶解酶和细胞因子（GZMB、LTA、LIF和IFNG）、细胞因子受体（IL2RA）和转录调节因子（FOSB和BATF3）上调。与记忆表型相关的基因转录本，如LEF1和TCF7，抑制性受体，如CD96和PDCD4，以及参与调节性T细胞生成的分子。如SMAD3，均被大幅下调。细胞因子信号分析（CytoSig）一致显示，促增殖和炎症细胞因子IL-2、IL-12和IL-15在4D5咬唾液酸酶处理的T细胞中活性增加最显著，而抑制细胞因子TGF-β3的活性下调（图4n）。
图4: 4D5BiTE-唾液酸酶在杀死HER2阳性靶细胞和激活T细胞的活性优于4D5 BiTE
- 与原始的BiTE相比，靶向HER2的BiTE-唾液酸酶促进更强的IS形成
在4D5BiTE-唾液酸酶诱导的IS中，F-actin、CD3、HER2和pZAP70的积累明显更强（图5a）。通过对这些结构和信号分子的总荧光强度（TFI）和HER2抗原进行定量，发现与4D5BiTE诱导的突触相比，这些分子在4D5唾液酸酶诱导的突触中富集量明显更高（图5b-e）。
图5: 4D5BiTE-唾液酸酶促进SK-BR-3细胞和Jurkat细胞之间更强的IS形成
- 在免疫缺陷小鼠的异种移植模型中，BiTE-唾液酸酶比BiTE更能有效地控制肿瘤。
为验证体内疗效增强，利用人肿瘤小鼠异种移植模型对比了4D5 BiTE与4D5 BiTE-唾液酸酶。在NCG小鼠中，先皮下注射SK-BR-3-luc细胞，再腹腔注射hPBMCs。随后，第七天小鼠随机分为三组，分别接受PBS、4D5 BiTE或4D5 BiTE-唾液酸酶治疗。在治疗后5小时检测血清IFNγ水平，显示4D5 BiTE-唾液酸酶组IFNγ水平最高（图6b）。通过生物发光成像（BLI）监测肿瘤生长，4D5 BiTE-唾液酸酶显著延缓肿瘤进展，并在部分小鼠中实现肿瘤根除（图6c-e）。
我们采用原位异种移植模型评估CD19 BiTE-唾液酸酶。小鼠静脉注射CD19+ NALM-6细胞和hPBMCs后，分组接受不同治疗。结果显示，CD19 BiTE-唾液酸酶治疗组肿瘤生长缓慢，证实了唾液酸酶融合蛋白的体内抗肿瘤效果（图6g-h）。对照组与4D5 BiTE-唾液酸酶处理组间无显著差异，指示疗效依赖于靶向肿瘤细胞的接触（图6h）。
图6: BiTE唾液酸酶在体内比BiTE更好的肿瘤控制
参考链接：Zhuo Yang, Yingqin Hou, Geramie Grande, Jong Hyun Cho, Chao Wang, Yujie Shi, Jaroslav Zak, Yue Wan, Ke Qin, Dongfang Liu, John R. Teijaro, Richard A. Lerner & Peng Wu. Targeted desialylation and cytolysis of tumour cells by fusing a sialidase to a bispecific T-cell engager. Nature Biomedical Engineering 2024, 8, 499. https://www.nature.com/articles/s41551-024-01202-w
