Sci Adv丨能够捕获和释放荧光适体的RNA机器

大家好，今天分享一篇发表于Science Advances，题目为“An RNA origami robot that traps and releases a fluorescent aptamer”的文章，作者通过RNA折纸技术构建了一种能够捕获和释放荧光适体的RNA机器人。通讯作者是来自丹麦奥胡斯大学的Ebbe sloth Andersen教授。

研究背景：

RNA折纸技术利用RNA分子的碱基配对原理，构建出多样的复杂纳米结构。这种技术以单链RNA为基础，通过共转录折叠组装，实现细胞内的遗传编码和表达，广泛应用于RNA药学和合成生物学。RNA器件的设计通常受到核糖开关的启发，通过配体结合引发构象变化，释放功能基序，实现对剪接、转录和翻译的调控。进一步地，通过整合toehold介导的链置换和布尔逻辑门等机制，RNA器件能够实现对生物功能的精细调控。尽管如此，目前大多数RNA器件的调控仍依赖于碱基对的重构，而利用纳米机械转导和计算技术调节功能性基序的RNA器件尚不多见。

针对这一挑战，研究者开发了一种名为"Traptamer"的RNA机器人，它能够根据And布尔逻辑门识别两条RNA链，并释放荧光适体iSpinach，激活其功能。Traptamer装置采用了一种通用的RNA功能控制策略，展现出在RNA医学和合成生物学领域的广泛应用潜力。

实验结果：

1.设计用于捕获核酸适体的RNA折纸

研究指出，功能性RNA基序在长螺旋结构中可能因机械力作用而弯曲变形，导致功能失效。基于这一发现，本文设计了一种新型RNA折纸框架Traptamer，由多个双交叉连接的螺旋结构组成。以iSpinach荧光适体为例，Traptamer能够捕获并调控其与荧光染料DFHBI-1T的结合。Traptamer的设计中，iSpinach适体被置于三螺旋RNA瓦片的中心，外侧螺旋保持较短，迫使iSpinach适体脱离平面形成失活状态。为了激活iSpinach，作者在顶部和底部螺旋中分别集成了两条具有分支的接吻环（bKL），并在bKLs末端延伸出一个由6个核苷酸环和5个碱基对茎部组成的发夹，作为链置换的立足点。当同源RNA链（RNA Keys）入侵时，bKLs的相互作用被破坏，中心螺旋结构的约束解除，iSpinach适体恢复活性构象，实现与DFHBI-1T的结合。这一bKL环介导的链置换机制，如图1D所示，为RNA折纸技术提供了新的调控策略。

图1. 适体机械陷阱的设计。（A）陷阱设计的描述: 两个双交叉(blue)连接的三螺旋瓦片RNA折纸将iSpinach荧光适配体（PDB: 5OB3）纳入中间螺旋(green)，该结构由两个带分支的亲和环（bKl, magenta）连接在一起, bKl延伸出5-bp的茎部，末端有一个6-nt长的环，作为链置换的立足点。（B）Traptamer结构的示意图。（C）Traptamer打开机制的示意图。（D）通过环介导的链置换破坏bKl过程的示意图。

2.筛选可捕获及释放iSpinach适体的RNA折纸结构

为验证RNA折纸结构的捕获与释放功能，作者体外转录了11种RNA变体，每种标记为"L-R"，代表iSpinach基序两侧碱基对数。实验以无接吻环(No-KL)为对照，通过加入荧光染料DFHBI-1T测量各变体荧光值，发现11-11、12-12和13-12变体荧光较强(＞0.5)，15-14和16-15中等(0.2~0.5)，而13-13等其余变体荧光较低。进一步实验中，作者加入针对bKL A和bKL B的Key A和Key B，观察荧光变化。11-11等3个变体加入Keys后荧光无明显变化，表明捕获效率低。13-13和14-13可被Key A完全激活(荧光增强15~20倍)，Key B激活效率仅10%-30%。14-14中Key A激活效率52%，Key B 16%，同时加入则完全激活(22倍)，呈现AND逻辑门特性。15-14和16-15部分捕获，Keys激活效率低。15-15等3个变体Key A激活效率约90%，Key B约50%，类似OR逻辑门。

为关联荧光变化与RNA结构特性，作者使用RNAbulid软件对变体进行3D建模，分析KLs间距、方向及闭合所需扭转角度。结果表明，下旋角大于90°的变体荧光高且不可激活，如11-11等(红点)，表明捕获效率低。上旋角大于60°的变体荧光低且可激活，如13-13等(蓝点)，表明有效捕获。中等旋转角变体荧光和激活效率居中，如15-14等(黑点)。最终，14-14变体因对Key A和Key B的最佳特异性被选为后续研究对象(图D)。

图2. 筛选能够捕获和释放的RNA折纸。（A）RNA折纸变体的设计示意图。（B）不同RNA变体的背景荧光测量（RNA:100 nM；DFHBI-1T: 500 nM）。（C）不同变体在加入Keys（500 nM）50 min后折叠改变的荧光激活。（D）Traptamer变体中预期扭转角度和bKLs距离的点图。（E）变体14-14加入Keys 前后与配体DFHBI-1T产生的荧光强度。

3.Traptamer可逆性捕获的机制

先前研究已证明，引入anti-Key可实现bKL的可逆性开启，通过与Key上的立足点结合触发链置换，移除Key。在Traptamer中加入Key和anti-Key，可使适体在开闭状态间循环（图3A）。为研究立足点对Traptamer激活的影响，作者在Key的5'或3'端引入立足点，分别命名为t-Key和Key-t。实验发现，两种Key均导致不同程度的延迟反应，Key-t达到最大荧光速度更快，因此被用于后续实验。为验证Traptamer激活的可逆性，作者先投入5倍Key A-t和Key B-t，80分钟内荧光逐渐增强。随后加入2倍余量的anti-Key（A-t*或B-t*），荧光急剧下降，25分钟后降至最低，表明A-t*或B-t*可关闭部分荧光信号，协同作用可使荧光完全关闭。150分钟后再次加入4倍Keys，荧光逐渐恢复至初始水平（图3B）。结果表明，Traptamer能可逆地捕获和释放iSpinach适体，且与链置换速率密切相关。

图3. Traptamer14-14对iSpinach的可逆激活和失活。（A）Traptamer机器的周期示意图。（B）监测投入Keys和Anti-Keys时Traptamer14-14（100 nM）与DFHBI-1T随着时间荧光强度变化。

4.Traptamer捕获状态下冷冻电镜结构

荧光数据揭示了Traptamer14-14如何通过改变iSpinach适体的构象来阻止其与DFHBI-1T结合。为了深入理解iSpinach被Traptamer14-14捕获后的构象变化，作者利用冷冻电镜技术重建了捕获时的构象，清晰观察到双螺旋、交叉结构、bKLs以及约90°弯曲的iSpinach（图4A和4B）。进一步分析中，作者根据电镜密度图手工构建了3D模型，并将原始iSpinach模型灵活拟合至密度图中，得到了iSpinach变形状态的构象（图4C）。在天然状态下，iSpinach的结合袋位于G4构象和A-U配对之间，负责与荧光基团作用。然而，在Traptamer14-14模型中，结合袋发生弯曲，A45-U22配对占据了荧光团的空间，而G4构象未受影响。这种弯曲主要破坏了由A45-U22碱基对和凸出的U42碱基构成的三重盖构象，表明折纸框架中bKL形成的力量导致iSpinach发生铰链样变形，从而机械性失活。

图4. Traptamer 14-14共转录组装状态的低温电镜表征。（A）Traptamer 14-14的低温电镜图，分辨率为5.45 Å。（B）比较iSpinach晶体结构（PDB: 5OB3）（左侧）和基于低温电镜图谱模型（右侧）中iSpinach适体的弯曲程度。（C）比较iSpinach晶体结构和低温电镜图模型中iSpinach的结合袋。

结论与展望：

本文通过对Traptamer的探究，作者展示了一种新的结合传感、计算和驱动模块的方法，以获得依赖于变构调节和大构象变化来驱动的分子器件。通过灵活组合这些模块，可以构建多样化的RNA机器人设备，为医学、合成生物学和材料科学等领域带来新的应用前景。

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10954211/