Sci Adv丨能够捕获和释放荧光适体的RNA机器
大家好,今天分享一篇发表于Science Advances,题目为“An RNA origami robot that traps and releases a fluorescent aptamer”的文章,作者通过RNA折纸技术构建了一种能够捕获和释放荧光适体的RNA机器人。通讯作者是来自丹麦奥胡斯大学的Ebbe sloth Andersen教授。
研究背景:
RNA折纸技术利用RNA分子的碱基配对原理,构建出多样的复杂纳米结构。这种技术以单链RNA为基础,通过共转录折叠组装,实现细胞内的遗传编码和表达,广泛应用于RNA药学和合成生物学。RNA器件的设计通常受到核糖开关的启发,通过配体结合引发构象变化,释放功能基序,实现对剪接、转录和翻译的调控。进一步地,通过整合toehold介导的链置换和布尔逻辑门等机制,RNA器件能够实现对生物功能的精细调控。尽管如此,目前大多数RNA器件的调控仍依赖于碱基对的重构,而利用纳米机械转导和计算技术调节功能性基序的RNA器件尚不多见。
针对这一挑战,研究者开发了一种名为"Traptamer"的RNA机器人,它能够根据And布尔逻辑门识别两条RNA链,并释放荧光适体iSpinach,激活其功能。Traptamer装置采用了一种通用的RNA功能控制策略,展现出在RNA医学和合成生物学领域的广泛应用潜力。
实验结果:
1.设计用于捕获核酸适体的RNA折纸
研究指出,功能性RNA基序在长螺旋结构中可能因机械力作用而弯曲变形,导致功能失效。基于这一发现,本文设计了一种新型RNA折纸框架Traptamer,由多个双交叉连接的螺旋结构组成。以iSpinach荧光适体为例,Traptamer能够捕获并调控其与荧光染料DFHBI-1T的结合。Traptamer的设计中,iSpinach适体被置于三螺旋RNA瓦片的中心,外侧螺旋保持较短,迫使iSpinach适体脱离平面形成失活状态。为了激活iSpinach,作者在顶部和底部螺旋中分别集成了两条具有分支的接吻环(bKL),并在bKLs末端延伸出一个由6个核苷酸环和5个碱基对茎部组成的发夹,作为链置换的立足点。当同源RNA链(RNA Keys)入侵时,bKLs的相互作用被破坏,中心螺旋结构的约束解除,iSpinach适体恢复活性构象,实现与DFHBI-1T的结合。这一bKL环介导的链置换机制,如图1D所示,为RNA折纸技术提供了新的调控策略。
图1. 适体机械陷阱的设计。(A)陷阱设计的描述: 两个双交叉(blue)连接的三螺旋瓦片RNA折纸将iSpinach荧光适配体(PDB: 5OB3)纳入中间螺旋(green),该结构由两个带分支的亲和环(bKl, magenta)连接在一起, bKl延伸出5-bp的茎部,末端有一个6-nt长的环,作为链置换的立足点。(B)Traptamer结构的示意图。(C)Traptamer打开机制的示意图。(D)通过环介导的链置换破坏bKl过程的示意图。
2.筛选可捕获及释放iSpinach适体的RNA折纸结构
为验证RNA折纸结构的捕获与释放功能,作者体外转录了11种RNA变体,每种标记为"L-R",代表iSpinach基序两侧碱基对数。实验以无接吻环(No-KL)为对照,通过加入荧光染料DFHBI-1T测量各变体荧光值,发现11-11、12-12和13-12变体荧光较强(>0.5),15-14和16-15中等(0.2~0.5),而13-13等其余变体荧光较低。进一步实验中,作者加入针对bKL A和bKL B的Key A和Key B,观察荧光变化。11-11等3个变体加入Keys后荧光无明显变化,表明捕获效率低。13-13和14-13可被Key A完全激活(荧光增强15~20倍),Key B激活效率仅10%-30%。14-14中Key A激活效率52%,Key B 16%,同时加入则完全激活(22倍),呈现AND逻辑门特性。15-14和16-15部分捕获,Keys激活效率低。15-15等3个变体Key A激活效率约90%,Key B约50%,类似OR逻辑门。
为关联荧光变化与RNA结构特性,作者使用RNAbulid软件对变体进行3D建模,分析KLs间距、方向及闭合所需扭转角度。结果表明,下旋角大于90°的变体荧光高且不可激活,如11-11等(红点),表明捕获效率低。上旋角大于60°的变体荧光低且可激活,如13-13等(蓝点),表明有效捕获。中等旋转角变体荧光和激活效率居中,如15-14等(黑点)。最终,14-14变体因对Key A和Key B的最佳特异性被选为后续研究对象(图D)。
图2. 筛选能够捕获和释放的RNA折纸。(A)RNA折纸变体的设计示意图。(B)不同RNA变体的背景荧光测量(RNA:100 nM;DFHBI-1T: 500 nM)。(C)不同变体在加入Keys(500 nM)50 min后折叠改变的荧光激活。(D)Traptamer变体中预期扭转角度和bKLs距离的点图。(E)变体14-14加入Keys 前后与配体DFHBI-1T产生的荧光强度。
3.Traptamer可逆性捕获的机制
先前研究已证明,引入anti-Key可实现bKL的可逆性开启,通过与Key上的立足点结合触发链置换,移除Key。在Traptamer中加入Key和anti-Key,可使适体在开闭状态间循环(图3A)。为研究立足点对Traptamer激活的影响,作者在Key的5'或3'端引入立足点,分别命名为t-Key和Key-t。实验发现,两种Key均导致不同程度的延迟反应,Key-t达到最大荧光速度更快,因此被用于后续实验。为验证Traptamer激活的可逆性,作者先投入5倍Key A-t和Key B-t,80分钟内荧光逐渐增强。随后加入2倍余量的anti-Key(A-t*或B-t*),荧光急剧下降,25分钟后降至最低,表明A-t*或B-t*可关闭部分荧光信号,协同作用可使荧光完全关闭。150分钟后再次加入4倍Keys,荧光逐渐恢复至初始水平(图3B)。结果表明,Traptamer能可逆地捕获和释放iSpinach适体,且与链置换速率密切相关。
图3. Traptamer14-14对iSpinach的可逆激活和失活。(A)Traptamer机器的周期示意图。(B)监测投入Keys和Anti-Keys时Traptamer14-14(100 nM)与DFHBI-1T随着时间荧光强度变化。
4.Traptamer捕获状态下冷冻电镜结构
荧光数据揭示了Traptamer14-14如何通过改变iSpinach适体的构象来阻止其与DFHBI-1T结合。为了深入理解iSpinach被Traptamer14-14捕获后的构象变化,作者利用冷冻电镜技术重建了捕获时的构象,清晰观察到双螺旋、交叉结构、bKLs以及约90°弯曲的iSpinach(图4A和4B)。进一步分析中,作者根据电镜密度图手工构建了3D模型,并将原始iSpinach模型灵活拟合至密度图中,得到了iSpinach变形状态的构象(图4C)。在天然状态下,iSpinach的结合袋位于G4构象和A-U配对之间,负责与荧光基团作用。然而,在Traptamer14-14模型中,结合袋发生弯曲,A45-U22配对占据了荧光团的空间,而G4构象未受影响。这种弯曲主要破坏了由A45-U22碱基对和凸出的U42碱基构成的三重盖构象,表明折纸框架中bKL形成的力量导致iSpinach发生铰链样变形,从而机械性失活。
图4. Traptamer 14-14共转录组装状态的低温电镜表征。(A)Traptamer 14-14的低温电镜图,分辨率为5.45 Å。(B)比较iSpinach晶体结构(PDB: 5OB3)(左侧)和基于低温电镜图谱模型(右侧)中iSpinach适体的弯曲程度。(C)比较iSpinach晶体结构和低温电镜图模型中iSpinach的结合袋。
结论与展望:
本文通过对Traptamer的探究,作者展示了一种新的结合传感、计算和驱动模块的方法,以获得依赖于变构调节和大构象变化来驱动的分子器件。通过灵活组合这些模块,可以构建多样化的RNA机器人设备,为医学、合成生物学和材料科学等领域带来新的应用前景。
原文链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10954211/