NANO TODAY丨装载有STING拮抗剂的肾小管上皮细胞仿生纳米颗粒通过调节固有与适应性免疫从而缓解急性肾损伤
大家好，今天为大家分享的文献是2042年4月发表于NANO TODAY上的STING antagonist-loaded renal tubule epithelial cell-mimicking nanoparticles ameliorate acute kidney injury by orchestrating innate and adaptive immunity。
背景图
作者介绍
本文的通讯作者为上海交通大学医学院分子医学研究院的刘尽尧教授与上海交通大学医学院附属第九人民医院肾内科的丁峰教授。刘尽尧教授团队的主要研究方向包括：①新型生物医用高分子的可控制备；②药物传递系统的生物制备新技术；③智能仿生材料的生物合成新方法；④肿瘤的诊断、成像和治疗新策略。丁峰教授的主要研究方向包括：①原发性、继发性肾小球疾病的原理探究；②急性肾损伤的诊治；③各种血液净化技术的应用等。
研究背景
急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是由多种原因（如脓毒血症、肾毒性药物使用等）引起的一系列综合征，其中肾小球滤过率骤然下降，并造成体内代谢产物的潴留，扰乱水、电解质、酸碱平衡，危害各脏器功能。AKI在住院病患，尤其是ICU病人中的发病率与死亡率都较高。然而目前AKI的治疗仍十分有限，主要采取支持性策略，以纠正原发病因为主，临床上缺乏特效药物。
近几年有愈来愈多的研究聚焦于AKI中的免疫通路，包括固有免疫与适应性免疫两方面。已有文献证明AKI中常见有线粒体损伤，可导致线粒体DNA泄漏到细胞质，并激活环GMP-AMP合酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）途径，从而激发固有免疫系统并导致多种促炎细胞因子生成。另一方面, 适应性免疫系统在AKI的发病机制中也起着关键作用：淋巴细胞, 尤其是CD4+ T细胞, 在AKI中是十分重要的介质。固有免疫的激活可将Th1细胞招募到损伤部位, 导致炎症加剧；与此同时，调节性T细胞（Treg）和Th2细胞参与减轻和恢复肾损伤，这些抗炎T细胞亚群的免疫转移可使得促炎细胞因子减少，并改善AKI小鼠的肾脏修复。因此，能够同时调节固有和适应性免疫以重塑炎症微环境的方法对于治疗AKI具有重要意义。
使用拮抗剂阻断固有免疫调节途径已被广泛用于抑制炎症反应，其中，拮抗剂C176可有效阻断STING活性，减少炎症细胞因子水平，并缓解顺铂诱导的肾小管损伤。另一方面，源自母细胞的细胞膜因为保留有天然的功能组分，已被较多研究者用作纳米递送介质，并可以启动保护性适应性免疫反应（例如已有较多研究制备出肿瘤细胞膜包被的纳米颗粒用于直接与树突状细胞（DCs）相互作用，从而促进抗原呈递）。作为肾小管的最关键组成部分，肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells, TECs）可以与多种细胞相互作用以减弱免疫激活。在炎症环境下，近端TEC s显著上调程序性细胞死亡配体1（PD-L1）的表达，该配体通过与DCs上的CD80竞争性相互作用，阻断共刺激信号，从而抑制T细胞增殖。此外，受到刺激的近端TECs上的PD-L1还可以诱导CD4+ T细胞分化为抗炎表型，并降低CD8+ T细胞的活性。因此，作者们便尝试将STING拮抗剂C176与TECs衍生的细胞膜结合，利用后者作为纳米介质，递送前者至肾脏，并实现针对固有与适应性免疫调节的双重治疗，从而缓解AKI带来的炎症损伤。
研究结果
图1 SNP@TEC的合成与表征
鉴于PD-L1在正常TEC上低水平表达，研究者首先用干扰素-γ刺激静息TEC 24 小时以上调细胞膜上的PD-L1表达，然后收集刺激后的TEC膜。接着，研究者选择了cGAS-STING途径的常见拮抗剂C176，并将其装载到聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA） 纳米颗粒（NPs）中，最后使用文献中的挤压法将其包覆于TEC膜内（图1A）。研究者通过通过动态光散射（图1B）、Zeta电位测量（图1C）、透射电镜（图1D）等方法对SNP@TEC进行表征，提示SNP@TEC合成成功。此外，研究者还通过Western Blot证实了SNP@TEC保留有关键的TEC膜蛋白质，包括PD-L1、αV整合素和NaK ATP酶（图1E）。最后，研究者还评估了拮抗剂C176的释放情况，结果显示，在最初的6小时内，61.78±3.57%的C176从SNP@TEC中释放出来，随着孵育时间延长至24小时，药物的释放得到持续（图1F）。以上结果皆表明SNP@TEC已被成功制备，可投入下一步使用。
图2 .TEC膜赋予SNP@TEC肾脏靶向的能力
作为一种上皮细胞，TECs已被证实在其膜上表达粘附分子，如整合素家族。鉴于整合素可以介导细胞之间的同类相互作用，研究者推测TEC膜可能可以促进纳米颗粒（NP@TEC）在肾脏中的积累。为了确认这一假设，研究者将TECs与DiD标记的NP@TEC共孵育，12小时后，与NP@RBC组（RBC即红细胞，其细胞膜表面不表达整合素，故用作对照组）相比，NP@ TEC组中TECs周围观察到明显增强的荧光信号，提示两者间的结合（图2A）。流式细胞术分析再次证实了这一点（图2B），而使用了αV整合素的特异性抑制剂后，可以观察到荧光信号大大减少（图2C），提示NP@TEC是通过αV整合素介导的粘附作用从而特异性靶向TECs。 研究者们进一步在小鼠体内评估NP@TEC的靶向能力：小鼠在注射纳米颗粒及其对照组6小时后处死，结果显示，与NP@RBC相比，NP@TEC在肾脏的富集显著增加（图2D和E）。此外，与NP@RBC相比，在近端肾小管中可观察到大量NP@TEC（图2F）。以上结果皆证明使用TEC膜包被可以改善NPs对于肾脏的靶向性，尤其是对于近端肾小管的靶向能力，这也是有效治疗AKI的先决条件。
图3 SNP@TEC对于STING通路的抑制
对临床AKI与非AKI患者的肾脏标本进行免疫组化染色，相应的图像和定量分析证实了肾脏有损伤的标本中STING的表达显著增加（图3A和 B），提示抑制cGAS-STING途径可能有助于AKI的治疗。为了进一步评估 SNP@TEC对STING途径的抑制能力，研究者向顺铂诱导AKI的小鼠尾静脉注射SNP@TEC，并以PBS、游离C176和NP@TEC作为对照（图3C）。顺铂给药后，与健康对照相比，AKI小鼠肾小管中STING的mRNA和蛋白水平皆明显增加（图3D和E）。同样的，顺铂诱导引起了STING下游物质TBK1的磷酸化增加和IFN-α的转录水平升高（图3F和G）。与游离C176相比，SNP@TEC治疗显著减轻了顺铂诱导AKI小鼠体内STING-TBK1-IFN-α途径的激活（图3D-G）。
除却cGAS-STING通路外，巨噬细胞也是固有免疫中的重要一环。已有研究证实STING的激活可将巨噬细胞从抗炎M2表型重新编程为促炎M1表型，因此研究者随后探讨SNP@TEC治疗是否能促进M2巨噬细胞极化。结果显示，完整的纳米颗粒治疗后，小鼠肾脏中CD206+：CD86+巨噬细胞的比例显著升高，证实了巨噬细胞向抗炎表型的重新极化（图3H）。而这种炎症逆转的表现在NP@TEC组中并未观察到，证明了这是STING拮抗剂引发的特定效应。综上所述，以上结果验证了SNP@TEC能够抑制受损肾脏中由STING通路介导的固有免疫激活的能力（图3I）。
图4 SNP@TEC对于CD4+T细胞分化和增殖的影响
作为肾脏中的一种驻留细胞，TECs能够通过多种机制阻止过度炎症的发生，其中，得益于TECs表面的PD-L1，受到炎症刺激的TECs可以直接促进CD4+T细胞从促炎性向抗炎性表型转变，并通过调节DC激活间接抑制CD4+T细胞的增殖（图4A）。因此，研究者尝试在下一步探究SNP@ TEC能否影响适应性免疫中CD4+T细胞和DC细胞的功能。研究者将NP@TEC与从小鼠脾脏分离的CD4+T细胞共孵育1小时后，共聚焦成像证明了两者间的相互作用（图4B）。为了确定T细胞的分化状态，CD4+T细胞与NP@TEC共孵育72小时后用流式细胞术检测，结果提示，与PBS或NP@RBC两个对照组相比，NP@TEC孵育组表现出显著的Th2偏向分化，具体表现为产生IL-4的Th2细胞比例升高，产生IFN-γ的Th1细胞比例下降（图4C）。同样的，NP@TEC组中Treg与Th17细胞的比例明显升高（图4D）。这些数据表明NP@TEC可以促进抗炎T细胞的分化，从而有效缓解炎症环境。
另一方面，为了研究NP@TEC对DCs的影响，研究者将DiD标记的NP@TEC与骨髓源树突状细胞（BMDCs）共孵育。在与NP@TEC孵育1小时后，BMDCs周围出现显著的荧光信号，提示它们之间的相互作用（图4E）。BMDC在受到LPS激活后，与NP@TEC共孵育可使得共刺激分子CD80的水平显著下调，提示DC活化受到竞争性阻断（图4F）。 此外，CFSE实验（一种常用的活细胞标记技术）证实，与PBS和NP@RBC组相比，NP@TEC处理后的DCs可导致CD4+T细胞亚群稀释比例显著降低，表明CD4+T细胞的增殖受到抑制（图4G和H）。
为了进一步探究NP@TEC能否在体内抑制适应性炎症反应，研究者向小鼠腹腔内注射了顺铂从而诱导AKI，并在不同时间点注射NP@TEC（图4I）。与体外结果一致，NP@TEC 显著减少了肾脏中总CD4+ T细胞的比例，同时促进了抗炎Th2和Treg表型的优先分化（图4J-L）。综上所述，以上结果证明包被在NPs上的TEC膜可以通过影响CD4+T细胞的增殖和分化来抑制适应性免疫，这对于抑制炎症至关重要。
图5 SNP@TEC对于顺铂诱导AKI小鼠的保护作用
前文已经证明了SNP@TEC在体内外皆具有调节固有免疫和适应性免疫的能力，下一步研究者将注意力转向评估SNP@TEC作为AKI治疗候选药物的价值（图5A）。结果显示，使用SNP@TEC治疗能够显著降低顺铂诱导AKI小鼠的血清肌酐水平（图5B）。此外，作为肾小管损伤的重要标志物，KIM-1在接受SNP@TEC治疗的AKI小鼠中明显减少，且比起游离C176组更低（图5C）。对受损肾脏进行PAS染色，可以看到显著的刷状缘丧失 、空泡化、管型形成、TEC脱落和炎症细胞浸润，而与其他所有组相比，SNP@TEC治疗显著减轻了这些结构损伤（图5D和E）。此外，剪切caspase-3的蛋白水平和TUNEL实验结果皆证实SNP@TEC可以减轻肾脏细胞的凋亡水平（图5F和G）。不仅如此，与PBS组相比，SNP@TEC治疗显著缓解了受损肾脏的线粒体功能障碍，具体表现为ATP产量的增加，MDA水平的降低以及线粒体结构形态的改善（图5H-J）。
图6 SNP@TEC对于缺血再灌注诱导AKI小鼠的保护作用
缺血再灌注损伤（I/R）是AKI的另一个主要原因，因此下一步研究者计划在I/R诱导AKI的小鼠中进一步评估SNP@TEC带来的保护作用（图6A）。结果显示，SNP@TEC治疗显著缓解了小鼠的肾功能障碍，具体表现为小鼠血清肌酐和炎症因子IL-6水平的降低（图6B和C）。病理图像和肾脏损伤评分亦验证了SNP@TEC治疗可有效改善肾小管损伤（图6D和E）。综上所述，与顺铂诱导的AKI实验组结果类似，SNP@TEC可以有效地保护小鼠免受I/R诱导AKI的影响。
图7 SNP@TEC对于AKI向CKD慢性转化的预防
在严重AKI中，若肾小管细胞修复不足，将不可避免地增加向慢性肾脏病（CKD）慢性化过渡的风险，肾脏将逐渐纤维化并永久丢失功能。前文已成功验证SNP@TEC治疗AKI的能力，因此最后研究者想进一步探索SNP@TEC是否也可以预防AKI向CKD的转化。 为验证这一假设，研究者通过对侧肾切除建立了一侧I/R损伤的CKD小鼠模型，在肾切除术后的第0、1和2天，向肾损伤小鼠分别静脉注射SNP@TEC、PBS、游离C176和NP@TEC，并在小鼠I/R损伤后的第28天将其安乐死以检测肾脏的结构和功能（图7A）。结果显示，I/R损伤的小鼠体重迅速下降，而SNP@TEC组小鼠的体重大部分恢复到假手术对照组的水平（图7B）。此外，SNP@TEC治疗组小鼠的血清肌酐水平缓解最多（图7C）。Masson染色组织学分析及相应的定量结果显示，I/R受损的小鼠肾脏发生了严重纤维化，而SNP@TEC组比PBS组和游离C176组更有效地减轻了纤维化的水平（图7D和E）。此外，SNP@TEC治疗显著降低了在纤维形成中起重要作用的α-SMA的水平（图7F和G）。小鼠肾脏切片染色结果也显示SNP@TEC组中肾脏巨噬细胞的浸润显著减少，提示肾脏中的炎症得到缓解（图7H）。综上所述，以上结果皆证明SNP@TEC可以通过减轻急性期的肾脏损伤，有效地预防AKI向CKD的慢性病理转化。
研究总结
本文的研究者们设计并合成了一种针对AKI以及AKI向CKD慢性转化的生物模拟纳米颗粒（SNP@TEC）。该纳米颗粒能够在体内外针对固有免疫与适应性免疫同时调节，双管齐下缓解肾脏损伤。
SNP@TEC的内部为装载有STING拮抗剂C176的PLGA核心，而在该核心外包被有源自肾小管上皮细胞的细胞膜。由于SNP@TEC保留了细胞膜上的αV整合素，其能够通过同源趋向性靶向肾小管，而内部携带的STING拮抗剂C176可以通过缓解STING引发的炎症反应和重新极化巨噬细胞至抗炎M2表型从而抑制固有免疫反应。由于受到炎症刺激的肾小管上皮细胞膜上表达PD-L1，SNP@TEC还可以借助该配体阻断树突状细胞上的CD80从而激活抗炎性适应性免疫反应，并抑制T细胞的激活。在两种AKI小鼠模型（顺铂或缺血/再灌注诱导）中，注射SNP@TEC能够显著减轻肾损伤并恢复肾功能，且能有效防止AKI的慢性化转变。综上所述，SNP@TEC十分独特地桥接了固有免疫和适应性免疫，有望在未来实现临床转化。但在考虑进一步转化之前，仍需要更为系统性地优化C176的装载和释放效率、SNP@TEC的注射剂量和频率，并进一步探究其体内的安全性，这也是本文未能实现的几处局限性。
原文链接
Shen, Y.; Yang, F.; Wu, F.; Zhang, M.; Deng, B.; Wu, Z.; Li, J.; Shen, Y.; Wang, L.; Ding, F.; et al. STING Antagonist-Loaded Renal Tubule Epithelial Cell-Mimicking Nanoparticles Ameliorate Acute Kidney Injury by Orchestrating Innate and Adaptive Immunity. Nano Today 2024, 55, 102209, doi:10.1016/j.nantod.2024.102209.
