JACS丨适体信号传导机制的比较揭示了传感器响应和消除错误信号

大家好，今天分享的文献是2023年5月发表在JACS上的题为Comparison of Aptamer Signaling Mechanisms Reveals Disparities in Sensor Response and Strategies to Eliminate False Signals的文章。

作者介绍：

本文的通讯作者是来自美国佛罗里达国际大学化学与生物化学系的肖艺副教授，课题组的研究方向包括（1）基于纳米材料的生物传感器、（2）DNA生物传感器、（3）体外定向进化。

背景介绍：

核酸适体是从体外筛选出来的寡核苷酸，它们能够与目标分子以极高的亲和力结合。核酸适体具有成本低、稳定性强以及易于进行化学改造等优势。适体生物传感器是适体技术的一种衍生应用，它能够将适体与目标分子的结合转化为可测量的信号，通过多种方式实现这一转化。尽管适体传感器的发展潜力巨大，但在实际应用中，对特定浓度的分析物进行检测，同时确保足够的亲和力和特异性，仍然是一个具有挑战性的任务。

结果与讨论

1.用核酸外切酶消化法筛选氟尼辛结合适体

在先前的研究中，作者采用了固定文库的SELEX技术，成功筛选出了能够与氟尼辛——一种用于动物的抗炎小分子药物——具有高度亲和性的适体。接着，作者利用T5核酸外切酶（T5 Exo）和核酸外切酶I（Exo I）的混合物对筛选出的25个适体候选物进行了进一步筛选。T5核酸外切酶能够降解5'至3'方向的单链和双链DNA，而核酸外切酶I则能降解3'至5'方向的单链DNA。当适体未与目标分子结合时，这些酶会将其分解为单个核苷酸。然而，一旦适体与目标分子结合，酶的降解能力会受到抑制。为了监测这一过程，作者在酶消化过程中采用了SYBR Gold对完整的DNA进行染色，并测量了剩余寡核苷酸的荧光强度。在实验中，作者分别在10μM和100μM的氟尼辛存在下对25个候选适体进行了酶切处理。结果发现，在100μM氟尼辛的环境下，部分适体显示出了抗消化能力。但更值得注意的是，在10μM氟尼辛的条件下，有7个适体表现出了同样强大的抑制作用，它们分别是FX1、FX3、FX4、FX5、FX35、FX40和FX46（见图1A）。为了进一步验证这些适体与氟尼辛的结合能力，作者采用了等温滴定量热法（ITC）对这7个序列进行了测试，结果显示它们的解离常数（KD）在200-350nM之间。这表明这些适体与氟尼辛的结合具有很高的亲和力。

2. 结构转换适体的鉴定和表征

在先前的研究中，作者发现通过核酸外切酶酶切法产生的截短适体能够根据是否与目标分子结合而改变其构象。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），作者鉴定并合成了多个适体序列，包括FX1-42、FX3-41、FX40-42等。进一步利用等温滴定量热法（ITC）评估显示，5'端悬垂物钝化后的适体具有更高的结合亲和力，与亲本适体相似。FX40-37适体表现出最高的亲和力，其解离常数（KD）为0.23±0.03μM。圆二色性（CD）光谱分析揭示了所有适体结合目标分子时的构象变化，其中FX40-37在结合过程中构象变化最大，显示了最强的氟尼辛亲和力和结构转换功能。

3. 适体信标荧光传感器的分析性能

基于FX40-37这一特定适体，作者开发了一种新型的适体信标传感器。该传感器在FX40-37的5'端和3'端分别标记了Iowa Black FQ淬灭剂和荧光素。在未与目标分子结合时，适体保持展开状态，此时淬灭剂与荧光素相互远离，荧光得以发出。然而，一旦适体与目标分子结合，适体的双链茎会重新组合，导致荧光被淬灭。为了测试传感器的性能，作者使用了不同浓度的氟尼辛与传感器进行反应，观察到荧光猝灭呈现出较小的浓度依赖性。考虑到荧光团和猝灭剂的两端附着可能有助于稳定适体的折叠构象，作者设计了一种“混合信标传感器”来提升灵敏度。这种传感器通过在结构中加入一段与适体结合域部分杂交的cDNA，增强了荧光团与猝灭剂的分离，从而在没有目标分子时保持较高的基线荧光。当目标分子存在时，适体发生构象变化，导致cDNA位移，进而引起荧光猝灭（见图2A）。

为了设计合适的cDNA，作者利用体外筛选该适体的高通量测序数据，通过MEME软件确定了一个共识基序（见图2B），并合成了针对FX40-37结合域5'端的前10个核苷酸区域的7、8和9个核苷酸长度的cDNA。随后，作者评估了它们与FX40-37-FQ的结合能力（见图2C）。在比适体本身高5倍的浓度下，cDNA-9B使FX40-37-FQ的荧光增加了约130%，表明它与适体结合良好（见图2D）。通过使用不同浓度的氟尼辛与FX40-37-FQ-cDNA-9B复合物反应，作者发现在饱和氟尼辛浓度下的最大猝灭效率为50%，可测量的检测限（LOD）为50nM，比单独使用适体时低了4倍（见图2E）。在后续实验中，作者测试了这种混合信标传感器对各种潜在干扰物的特异性（见图3A）。他们首先使用5'FAM标记的完全折叠亲本适体FX40（FX40-FAM）进行对照实验，以排除干扰物本身可能引起的固有猝灭效应。在确定传感器响应和交叉反应性时，作者减去了这种非特异性猝灭。当使用cDNA-9B测试FX40-37-FQ对100μM干扰物的响应时，除了奎宁、新霉素、氯丙嗪、莱克多巴胺和环丙沙星显示出≥25%的交叉反应性外，其他干扰物的交叉反应性均较小（见图3B）。这表明混合信标传感器具有较高的特异性。

4. 适体信标传感器特性的生物物理研究

作者通过等温滴定量热法（ITC）测试了干扰物与FX40-37的结合亲和力，结果表明，除了环丙沙星，其他干扰物的结合亲和力都低于预期（见图3C）。接着，他们使用微尺度热泳术（MST）来评估这些干扰物对3'Cy5标记的FX40-37的亲和力，结果与ITC大体一致，但无法解释在高浓度氟尼辛（100μM）下干扰物的高交叉反应性。

为了验证干扰物是否会诱导适体形成不同于氟尼辛的替代构象，作者对FX40-37在单独或与氟尼辛、新霉素、氯丙嗪、奎宁或环丙沙星共同存在的情况下进行了圆二色性（CD）光谱分析（见图3D）。分析结果显示，氟尼辛诱导的FX40-37构象变化与其他干扰物引起的变化不同。这说明同一适体可以根据不同结合配体形成不同的构象。这也表明，适体信标传感器可能会受到与核酸弱关联分子的非特异性结合影响，从而产生错误信号，并可能以某种方式改变适体的结构。

5. 利用Exo I试验评估适体构象变化

作者通过Exo I实验进一步探究了配体对FX40-37构象变化的影响。他们分别在有无氟尼辛以及干扰物奎宁、环丙沙星、新霉素、氯丙嗪存在的情况下，观察了Exo I对适体的酶切效果。结果显示，在氟尼辛存在时，Exo I的消化作用受到显著抑制。而新霉素和环丙沙星虽然也表现出了一定的耐药性，但远低于氟尼辛的水平；氯丙嗪的耐药性次之，而奎宁的耐药性则是最低的。此外，作者还对亲本适体FX40进行了Exo I酶切实验，结果发现无论是否存在靶标，FX40都未被消化。这可能是因为FX40始终保持着双链茎的结构。综合这些数据，我们可以得出以下结论：新霉素、环丙沙星和氯丙嗪能够诱导FX40-37发生一定程度的构象变化，而奎宁虽然能与适体结合，但不足以引起足够的构象变化来阻止酶的消化作用。这表明，不同配体对适体构象的影响是具有选择性的，而这种选择性变化对于适体信标传感器的设计和应用具有重要意义。

6. 使用T5 Exo/ Exo I试验评估适体特异性

作者采用T5 Exo/Exo I消化实验来分析适体与交叉反应性干扰物的结合情况，并据此制作了校准曲线。实验中，他们使用不同浓度的氟尼辛与T5 Exo/Exo I的混合物作用于FX40适体，并在不同时间点测量荧光强度。结果显示，在100μM浓度下，新霉素和环丙沙星能够抑制适体的消化，而奎宁和氯丙嗪则似乎加速了消化过程。这表明干扰物与适体的结合方式与氟尼辛不同。为了深入研究这一现象，作者进一步用不同浓度的这四种干扰物对FX40进行消化实验。结果表明，不同干扰物与适体的结合方式存在差异。这些发现有助于我们理解干扰物如何影响适体的结构和功能，对于优化适体信标传感器的设计具有重要意义。

7. 基于适体的链置换传感器的分析性能。

作者研究了另一种基于适配体的传感器常用的信号方式——链置换传感机制，通过在适体的5‘端用荧光素修饰（FX40-FAM)，在合成的14-nt的cDNA的3’端用dabcyl淬灭基团标记。当不存在靶标时，cDNA与适体部分杂交，荧光淬灭；当存在靶标时，靶标取代cDNA与适体结合，发出荧光（见图5A）。同样，作者先使用不同浓度的氟尼辛与上述链置换信号传感器反应以构建氟尼辛检测校准曲线并得到了在100μM氟尼辛存在下的信号饱和曲线（见图5B）。接下来作者在10μM氟尼辛和100μM干扰物存在的情况下测试了链置换传感器的交叉反应性，可以看到该传感器对任何干扰都没有反应，包括新霉素、环丙沙星、氯丙嗪和奎宁(见图5C)。为了进一步探究适配体的抗干扰性，作者使用10μM的氟尼辛分别与10μM干扰物或100μM干扰物形成二元混合物，并使其与传感器反应，可以看出前者除环丙沙星存在25%的信号抑制外，其他干扰物对信号的影响不显著；后者则存在明显的信号抑制（见图5D），这说明这些干扰物倾向于稳定适体cDNA复合物。作者试图通过稀释来解决这种干扰问题（见图5E），可以看出干扰物对信号的抑制降低。最后作者使用这样的传感器在胎牛血清中进行了氟尼辛检测，LOD为50nM。

8. 确定链位移传感器特异性的机制

FX40是通过体外筛选出的可以特异性地结合氟尼辛并从cDNA中置换出来的DNA序列，为进一步地提高适体的特异性，作者通过反筛的方法，筛选出了那些只有在与氟尼辛结合时才能够发生链置换而在干扰物存在时不一定发生链置换的适体。

9. 利用竞争寡核苷酸调整适体信标传感器的特异性

为了提高链置换传感器的特异性，作者在cDNA-9B的基础上合成了新的cDNA探针，包括与cDNA-9B杂交位置不同的cDNA-9E（见图6A）。这些cDNA通过不同长度和位置增强FX40-37-FQ的荧光（见图6B），其中较长的cDNA更能使适体保持非折叠状态。实验发现，仅cDNA-9E、cDNA-10A、cDNA-11A、cDNA-10B和cDNA-11B能显著增加信号的靶向浓度依赖性（见图6C,D）。进一步测试这些传感器的特异性显示，适配体与cDNA-9E、cDNA-10B和cDNA-11B结合后，对奎宁和氯丙嗪的特异性有所提高（见图6E）。cDNA阻断的适体区域向5'端移动可阻止奎宁和氯丙嗪诱导的信号，从而提高特异性。cDNA-9E还提高了对环丙沙星的特异性，表明环丙沙星与适体茎结合，而cDNA-9E的杂交消除了这一结合位点。但没有任何cDNA能提高对新霉素的特异性，是因为新霉素可能通过静电作用非特异性结合适体，扰乱其构象。最后，作者评估了cDNA-9E适体复合物在氟尼辛和干扰物二元混合物中的反应。图6F显示，在1:1混合时干扰最小；当比例增至1:10时，环丙沙星引起25%的信号抑制，稀释后抑制减少（见图6G）。这表明混合信标传感器在含有干扰物的混合物中比链置换传感器具有更强的抗干扰能力。

10. 证明了与其他适体在传感器响应中观察到的差异的普遍性

作者为了测试链置换传感器和适体信标传感器的灵敏度和特异性是否也适用于其他的适体，基于最近从两个不同的SELEX实验中分离出的两个DNA适体构建了新的链置换传感器E2-FAM（靶标为芬太尼）、F27-FAM（靶标为呋喃芬太尼）和截短茎后的适体信标传感器E2-34-FQ（靶标为芬太尼）和F27-38-FQ（靶标为呋喃芬太尼）（见图7A），并且可以观察到这两种传感器分别对芬太尼和呋喃芬太尼具有浓度依赖性，除此之外还可以观察到适体信标传感器相对于链置换传感器灵敏性更好，拥有更低的LOD（见图7B,D）。在后续的实验中作者分别设计实验检测了两种传感器的特异性，发现两种传感器都展现出了高特异性(见图7C,E)，但是对于适体信标传感器来说，某些分子或干扰物可能会诱导适体信标传感器产生不成比例的大假阳性信号。

总结：

1. 作者研究了适体信标传感器和链置换传感器的特异性和亲和力，发现相同适体在不同传感模式下可能表现出不同特异性。核酸非特异性分子如环丙沙星可能干扰适体信标传感器，导致假阳性；而链置换传感器可能因信号抑制产生假阴性。

2. 作者开发了一种新型混合信标传感器，结合链位移竞争机制，提高了灵敏度和选择性。该方法显著降低了对奎宁、氯丙嗪和环丙沙星的交叉反应，但对新霉素无反应。

3. 尽管counter-SELEX技术可以去除一些干扰序列，但要去除那些与目标结合域外发生干扰作用的序列仍具挑战。

4. 文章强调了对适体传感器响应进行全面测试的重要性，并指出作者的研究结果支持一种比传统counter-SELEX更有效的特异性优化方法。

文献信息：

Alkhamis O, Canoura J. et al. Comparison of Aptamer Signaling Mechanisms Reveals Disparities in Sensor Response and Strategies to Eliminate False Signals. J Am Chem Soc. 145(22):12407-12422 (2023).

https://doi.org/10.1021/jacs.3c03640