Nat Biotechnol丨具有按需可逆性的超分子抗凝剂的开发

Development of supramolecular anticoagulants with on-demand reversibility （具有按需可逆性的超分子抗凝剂的开发）

大家好，今天给大家带来的文献是瑞士日内瓦大学Nicolas Winssinger课题组的工作。题目是：具有按需可逆性的超分子抗凝剂的开发。抗凝药物是临床预防/逆转血栓形成的重要药物。血栓的形成主要是由凝血因子II，也就是（凝血酶）催化纤维蛋白原水解成为纤维蛋白，纤维蛋白进一步发生沉积形成血栓导致的。抗凝药物治疗的重要靶点就是凝血酶（凝血因子II）。目前临床常用肝素和华法林用于抗凝治疗，但这两种药物的治疗需要长期、持续的检测血药浓度，以保证不会抗凝过度引发的无法止血。当抗凝药物使用过量的时候，患者需要重新输入更多量的凝血因子，以中和过量的凝血药物。因此目前的抗凝治疗缺乏一个灵活简便的调控方式。

图1. 具有按需可逆的超分子药物

基于此，作者提出了一种按需可逆的强效抑制凝血酶活性的方法。具体设计是使用两种能结合凝血酶不同抗原表位的抑制剂，将这两种抑制剂分别与两条互补的肽核酸进行共价连接；此外，当带有肽核酸的凝血酶抑制剂与凝血酶结合后，这两条互补的肽核酸就会极大增加这个组装体与凝血酶的亲和力。而通过带有toehold的肽核酸即可解开这两种抑制剂与凝血酶的结合，从而释放凝血酶活性（图1）。

在凝血酶抑制剂的选择方面，作者受到了吸血生物的启发，比如水蛭、蜱虫、蚊子和苍蝇，这些生物的唾液里都有凝血酶抑制剂，从而使得他们在吸食血液后，血液不会在凝血酶的作用下凝固。这些凝血酶的抑制剂主要作用于凝血酶的两个位点。这两个位点分别位于凝血酶的活性中心以及II号外位点，距离在20-30A。对于靶向凝血酶活性中心的抑制剂，由于凝血酶是丝氨酸抑制剂，作者将能广泛结合丝氨酸蛋白酶的酮苯并噻唑修饰在能结合凝血酶活性中心的抑制剂上（A1）（图2）。

对于靶向外位点II的抑制剂，作者进行了结构调研，发现这些抑制剂中的酪氨酸都具有磺酸修饰，考虑到磺酸修饰是一种翻译后修饰，作者就选择了能够化学合成的磺酸类似物，二氟甲基苯丙氨酸（E1）。在合成方面，作者采用化学固相合成法合成了靶向凝血酶的fragmentA1，像刚才说的这个fragmentA用酮苯并噻唑修饰后，再连接上8nt长度的肽核酸，对于另一个结合外位点II的抑制剂fragmentE1作者也共价连接了8 nt的肽核酸，这个E1作者也进行二氟甲基苯丙氨酸修饰（图2）。

图2. 抑制剂的条件优化

经测试，FragmentA1对凝血酶活性的抑制在58.7nM，而单独E1对凝血酶没有抑制。但是当同时加入FragmenA1和E1，抑制浓度降了800倍，为74pM。此外，作者还测试了这个组装体对其他丝氨酸蛋白酶家族凝血因子的活性，发现这个组装体对凝血酶具有选择性抑制。进一步，作者还探究了肽核酸 linker长度对这个协同作用的影响，作者发现短至4nt的肽核酸依然具有协同抑制的活性，强于单独A1抑制剂的10倍。作者继续探究了在E1上修饰其他磺基酪氨酸类似物对外位点II结合段的影响，作者分别对第12、9、12+9酪氨酸进行苯甲酸二磺酸修饰，分析这些就是对组装体抑制凝血酶活性的影响，作者发现只有在12位酪氨酸修饰苯甲酸二磺酸才能显著增加该组装体对凝血酶的活性。作者进一步分析这个E1肽上第7号位丙氨酸对结构活性的影响，作者发现将丙氨酸替换成t-Leu才能显著增加活性（图2）。

接下来作者通过小鼠实验分析组装体在体内的抗凝效果，作为对照，作者将常用的抗凝药阿加曲班作为阳性对照。小鼠在分别接受A1E1组装体或阿加曲班治疗后，作者通过细针给小鼠造成外伤，模拟外源性凝血途径，并抽血分析小鼠外周血纤维蛋白的水平。纤维蛋白是由凝血酶催化纤维蛋白酶原产生的，所以纤维蛋白反应酶活性，结果显示A1E1组装体和阿加曲班具有类似的抗凝效果；此外，通过测量血栓体积，作者也发现A1E1组装体具有较强抗凝效果；最后作者通过体内成像来观测血栓，这个红色的是血小板、绿色的纤维蛋白，加入组装体或阿加曲班都能减少纤维蛋白从而减少血小板的富集，因此这个组装体在体外和体内都有较好的抗凝效果（图3）。

图3. 体内实验证实抑制剂可抑制凝血酶活性

为了实现按需的凝血酶活性调控，作者设计了一条带有toehold的解药链，从而将互补的肽核酸置换下来，解除抑制。为了检测这个解药的效果，作者首先分析这个组装体和解药联合使用的效果，结果显示，当同时加入组装体和解药后，无论是凝血酶活性还是其对纤维酶原的切割效果都获得了极大的恢复；此外，作者发现将解药链中的腺嘌呤替换成二甲氨基嘌呤，可以极大的加速连置换的速度，从而更快的实现解除抑制的效果，因为二甲氨基嘌呤和ATP的氢键是三条，因此会更快更稳定。作者同样的采用体外实验CAT和体内实验细针创伤实验验证了解药对于凝血酶活性恢复的验证。

图4. 凝血酶活性抑制的恢复

综上所述，作者设计了高度有效的双价凝血酶抑制剂，通过应用超分子二元片段的构成动态特性，其活性相对于单个片段提高了800倍。通过肽核酸实现了超分子配对，可以简单调节超分子复合物的解离动力学。这些分子与经典抑制剂之间的重要区别在于，动态平衡可以通过外部因素调节，从而提供一种简单的抑制逆转策略。