Angew | Tau寡聚化抑制核酸适体的功能筛选
大家好，本次分享的文献是2024年2月发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的“Functional Selection of Tau Oligomerization-Inhibiting Aptamers”。通讯作者是佛罗里达大学的Kevin K. Wang教授，本工作开发了一种新的筛选策略来筛选核酸适体，这些核酸适体能够在促进Tau聚集的条件下与单体Tau蛋白结合，为减轻Tau蛋白病相关神经退行性疾病的神经治疗药物铺平道路。
背景
Tau是正常成熟神经元中的主要微管相关蛋白，可稳定微管网络。在病理学上，过度磷酸化的Tau蛋白会从微管中分离出来，导致不良的积累和寡聚化，这是Tau蛋白病相关神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、皮克氏病、和慢性创伤性脑病）的病因学标志。低聚物Tau（Oligo-Tau）进一步聚合成成对的螺旋丝，导致神经原纤维缠结。因此，Tau蛋白病被认为起源于Tau的磷酸化和寡聚化。开发特异性抑制Tau聚集的功能分子是治疗神经退行性疾病的关键策略。
DNA或RNA由于其重复的骨架电荷，使它们能够在整个序列空间中保持溶解度。它们被认为是实验室体外进化（LIVE）的有前途的平台，以创造功能性生物聚合物并可能治疗各种疾病。与筛选技术相关的多种方法，核酸适体化学，和生物信息学已开发用于提高核酸适体质量（亲和力、特异性和稳定性）以及筛选效率、自动化和高通量。最近，研究人员还报道了使用镜像DNA聚合酶来筛选高度生物稳定的L-DNA核酸适体以及人工智能辅助核酸适体筛选,这些激动人心的结果正在推动核酸适体的迭代开发。目前，大多数筛选策略都集中在靶标结合上，导致核酸适体具有各种不可预测的功能能力。很少有努力直接促进功能发现，例如反应催化、合成核酶和DNA酶，在核酸适体筛选过程中。这一挑战也延伸到蛋白质功能筛选，根据第一性原理设计或筛选符合各种生物场景所需性能标准的分子是困难的。
为了靶向与Tau蛋白病相关的神经退行性疾病，作者利用实验室体外进化（LIVE）方法优化了现有Tau或Tau表位结合的核酸适体。先前筛选的DNA或RNA Tau核酸适体对靶标表现出高亲和力，但不能保证对Tau寡聚/聚集化的最佳抑制或调节。例如，这些结合事件可能发生在不参与聚集或过度磷酸化的蛋白质表位上。实际上，调节Tau相互作用和聚集的详细生理机制尚未完全了解。因此，为了筛选防止Tau病理学的核酸适体，作者首先开发了一种改进的功能筛选策略（图1A），以得到表现出寡聚/聚集化抑制功能的核酸适体（图1B）。
图1. 通过实验室体外进化工作流程发现的功能性Tau核酸适体。
这项新战略包括两个步骤。在第一步中，使用经典的凝胶移位策略进行凝胶电泳（GE）筛选富集Tau结合候选者的DNA库。在第二个筛选步骤（13轮）中，优先富集DNA核酸适体分子，这些分子在聚集诱导剂存在下仅结合Tau单体，而不是Tau寡聚体。假设只有核酸适体才能在这种筛选中幸存下来，才能阻止Tau形成低聚物。因此，这种内置的“反筛选”消除了结合寡核苷酸Tau但不能抑制Tau病理学的核酸适体候选物。事实上，该方法优化的核酸适体不仅以高亲和力结合Tau，而且能在体外抑制Tau寡聚化/聚集。此外，发现的核酸适体在无细胞和细胞环境中均能抑制Tau过度磷酸化。
结果与讨论
- 使用GE-Selection富集DNA库
最初的GE筛选旨在鉴定单链DNA（76个核苷酸）的DNA文库中是否有结合序列。天然非变性PAGE用于分析与单体Tau441蛋白（441个氨基酸长）孵育后的DNA文库（图2A）。在电泳过程中，未结合的DNA库表现出非特异性或弱结合，与紧密结合的复合物分离。流式细胞术用于进一步验证筛选。在此过程中，将FAM标记的随机文库和第1、2和3轮筛选后的DNA库与Tau（His-tagTau）和Ni-NTA树脂微珠一起孵育用于流式细胞术分析。单独的Tau蛋白和单独第1轮后的DNA库也被评估为对照。与对照组相比，流式细胞术偏移表明R1（第1轮）、R2和R3 DNA库已经包含对Tau具有强亲和力的DNA核酸适体（图2B）。
图2. 核酸适体筛选结果。
2. 功能筛选
然后使用来自第三轮GE-Selection的预选和富集的Tau结合DNA库作为起始文库进行筛选。为了在无细胞条件下生成Tau聚集体，作者首先尝试使用花生四烯酸（AA）和肝素诱导Tau聚集。AA被发现是Tau寡聚化/聚集的可靠诱导剂，因为它以剂量依赖性方式（50-100μM）促进Tau聚集，如变性SDS-PAGE所示（图2C）。在评估聚集诱导剂作用后，将Tau441单体与富含GE筛选的Tau结合DNA库在寡聚缓冲液中孵育进行筛选。然后通过非变性PAGE将Tau441单体及其结合的核酸适体与Oligo-Tau分离，AA的增加将导致mon-Tau的比例降低。切除凝胶中对应于Tau441单体和核酸适体的条带，候选序列在下一轮选拔中接受PCR扩增。在此功能筛选中，作者穿插了2轮常规Tau结合GE筛选。总共进行了15个循环的功能筛选，在第1、4、7、9、11、13和15轮检查了DNA库降低AA诱导的Tau寡聚化水平的能力（图2D）。
图2E显示了使用第1、4、7、9、11、13和15轮的核酸适体库孵育并与AA诱导聚集后Oligo-Tau与Mono-Tau的比率。从第一轮到第九轮，随着选拔轮次的增加，被选中库的抑制能力呈现出稳定状态。经过九轮筛选，低聚物/单体比值急剧下降，第13轮达到最低值。然而，经过两轮选拔（15轮），没有观察到进一步的改善。基于这些数据，第13轮的序列被克隆和测序，总结了最丰富的20个核酸适体候选体，并使用mFold软件和IDT网站软件预测核酸适体的二级结构。
3. 最佳tau核酸适体对tau441蛋白的结合和特异性
通过流式细胞术验证了十个最具代表性能够与Tau441的结合的序列（BW1至BW10）。在最佳核酸适体候选物中，BW1的荧光强度变化最大（绿色，图3A）。此外，通过斑点印迹证实了所选Tau核酸适体与全长Tau441蛋白的结合特异性。每个FAM标记的核酸适体都与硝酸纤维素膜一起孵育，硝酸纤维素膜已固定在靶Tau441蛋白或一组非靶标蛋白上（图3B）。
图3. Tau核酸适体分析。
每个Tau核酸适体（BW2-BW10）在天然Tau位置仅显示一个主条带。核酸适体BW1在Tau441位显示一条强条带，在P-Tau位显示一条较弱条带（由DYRKA激酶预磷酸化）。这意味着BW1也能够与P-Tau结合。核酸适体和非靶蛋白之间未观察到交叉反应性，包括α酪蛋白+β酪蛋白、BSA（牛血清白蛋白）和IgG（免疫球蛋白G）。
4. 抑制Tau聚集体外抗体测定
为了在体外测试候选核酸适体对花生四烯酸诱导的Tau寡聚化的抑制作用，将Tau蛋白与每个候选核酸适体或随机DNA库（作为对照）孵育30分钟，然后用AA处理12小时以诱导Tau寡聚体的形成。通过SDS-PAGE（图4A）分析产物，然后用多克隆总Tau抗体（DA923).在不含AA的PBS缓冲液中，检测到单体形式Tau441（~Mr68K）（泳道1），仅观察到微量的Oligo-Tau。然而，在结合缓冲液（泳道12）中形成了稍多的Oligo-Tau。AA的加入导致大量高分子量低聚物Tau（泳道14）的形成。所有测试的核酸适体（BW1至BW10）均显著抑制AA诱导的Tau寡聚化（泳道2至11）。相比之下，随机序列DNA文库则没有。如图4B所示，BW1对低聚Tau形成的抑制作用最强。在另一个实验中，作者将Tau441（2μM）与浓度递增的BW1（2μM）孵育30分钟，然后用AA进行寡聚化研究，并用DA9抗体进行蛋白质印迹。Tau低聚物的形成再次被核酸适体以剂量依赖性方式抑制。
图4. Tau核酸适体对体外Tau441聚集的抑制作用。
5. 核酸适体BW1的序列截断和修饰
鉴定出的核酸适体是从初始文库优化而来的全长序列，其两端各包含PCR扩增所需的固定引物结合区域。然而，全长核酸适体通常可以被截断，去除部分或全部引物结合区域，以提供更短的序列，而不会影响对其靶标的结合亲和力。在这里使用核酸适体BW1进行这种截断，因为它表现出最佳的结合能力和Tau聚集抑制能力。
基于RNA fold预测的二级结构（图5A）设计了BW1的两个截短版本（BW1a和BW1b）。这些截断保留了BW1的核心结构。BW1c在BW1b上进一步修改，在茎结构中用A:T对代替G:T对，假设这将有可能增强核酸适体的稳定性。所有改进核酸适体均通过斑点印迹测定法保持其与Tau441的结合和特异性（图5B）。
图5. Tau核酸适体BW1通过截断和核苷酸置换的序列设计。
对于这些核酸适体的动力学研究，将生物素标记的Tau441蛋白固定在生物层干涉测量仪（BLI）的表面上，并在溶液阶段向靶标呈递各种浓度的核酸适体候选物。实时测量Tau蛋白和配体之间的结合相互作用。平衡解离常数（Kd）、动能导通率常数（Kon）和离率常数（Koff）（图5C）。然而，截断后的BW1a和BW1b表现出较弱的条带强度和较高的Kd值，如与Tau441的结合亲和力降低所反映。重要的是，BW1c比BW1a或BW1b具有更强的结合亲和力，并且比BW1结合得更好。因此，作者推测核酸适体的茎结构在结合亲和力中具有重要意义，可能是通过稳定分子靶结合部分的活性折叠。
6. 抑制ThT结合测定表现出的核酸适体体体外Tau聚集
在成功截断和修饰核酸适体BW1以获得具有更高亲和力的核酸适体BW1c后，作者探索了所得核酸适体是否会保留其先前指导功能筛选过程的抑制功能。因此，作者研究了BW1c的抑制能力，以及BW1和先前发现的Tau核酸适体IT2a，比较基于结合标准的筛选与基于功能标准的筛选的核酸适体的抑制能力。硫黄素-T（ThT24）能够直接插入自组装多聚体蛋白中的β折叠结构。一旦结合，ThT会按结合量成比例发射荧光信号，用以量度Tau聚集的程度（图6A）。荧光的增加表明，AA极大地诱导了Tau的聚集。随着孵育时间的延长，荧光持续增加，直到达到平台期，表明聚集饱和。Tau、AA和随机DNA序列也观察到类似的增长趋势，这表明随机DNA对Tau聚集没有抑制作用。
图6. Tau核酸适体对Tau聚集和Tau磷酸化的影响。
然而，在三种Tau核酸适体（BW1c、BW1或IT2a）的存在下，AA诱导的Tau聚集和ThT荧光增加得更慢，饱和强度更弱。这证实了AA诱导的Tau聚集体的形成受到BW1c、BW1或IT2a核酸适体的显着抑制（图6B）。与作者的假设一致，与IT2a相比，BW1和BW1c对AA和肝素诱导的Tau聚集表现出更强的抑制作用（图6C）。当诱导剂为AA时，BW1和BW1c对Tau聚集表现出相似的抑制作用，尽管BW1c具有更高的亲和力。使用肝素时，BW1c在孵育早期表现出比BW1更好的抑制作用，但在较长的孵育时间长达12小时后，抑制作用趋于相同。这些数据表明从功能筛选中获得的BW1和BW1c对两种分子（AA和肝素）诱导的Tau聚集的抑制比通过传统结合驱动筛选获得的IT2a更强大和更理想。
7. 无细胞Tau磷酸化测定和Tau核酸适体的影响
虽然Tau的其他功能特征在功能筛选中没有直接靶向，但作者还探索了核酸适体是否也抑制它们，例如核酸适体是否可以抑制GSK3β激酶催化的Tau磷酸化。为此作者将Tau441（2μM）与BW1c、BW1和IT2a预孵育30分钟，在含有MgCl2的缓冲液中加入带有ATP的GSK3β激酶来测试。高亲和力Tau抗体（6μM，小鼠DA9单克隆抗体）取代核酸适体作为阳性对照。然后通过SDS-PAGE/蛋白质印迹法用Tau抗体（DAKOA0024，兔多克隆抗体）分析样品，进行非磷酸化Tau和磷酸化Tau定量。图6D显示，位于下面的条带被指定为非磷酸化的Tau（蓝色标签），位于上面的条带是体外GSK3β磷酸化诱导的磷酸化Tau。GSK3β磷酸化在迁移较慢的P-Tau条带中增加，同时非磷酸化Tau的信号降低（在图6E中量化）。核酸适体和抗体均以Mab DA9>BW1c≈BW1的顺序抑制GSK3β磷酸化（图6D，E）。在相同条件下，IT2a在阻止GSK3b介导的Tau磷酸化方面相对无效。
8. Tau蛋白在细胞模型中的抑制作用
在体外进行这些表征之后，作者好奇是否会在细胞内观察到类似的影响。具体来说，作者研究了Tau核酸适体在完整神经细胞中抑制Tau聚集的能力。为了实现这一点，作者使用神经N2a细胞，一种表达Tau蛋白的小鼠神经母细胞瘤细胞系作为模型。将N2a细胞与预混合的核酸适体BW1c（25 nM–400 nM）与Lipofectamine 2000（0.2%v/v）一起孵育。接下来，使用共聚焦显微镜显示Cy5标记的BW1c在Lipofectamine 2000存在下有效地进入N2a细胞的细胞质（图7A）。作者的实验室和其他实验室已经使用冈田酸（OA）来开发Tau蛋白病的细胞模型。OA抑制蛋白磷酸酶1和2A（PP1/PP2A）催化的P-Tau去磷酸化。通过不允许P-Tau去磷酸化，OA增强了Tau过度磷酸化，成为细胞培养物（包括N2a细胞）中的病理状态。野生型小鼠的OA治疗会导致大脑不同区域的Tau蛋白病相关异常。在一个tau蛋白病神经细胞模型中，用OA（100 nM）处理N2a细胞24小时以诱导Tau过度磷酸化和寡聚化，从而模拟tau蛋白病相关条件。在对N2a细胞进行OA处理后，使用蛋白质印迹法分析从细胞中提取的总细胞蛋白，DA9抗体可识别单体Tau（Mono-Tau，46kDa）、P-Tau（50–70kDa）和寡聚Tau（Oligo-Tau90–160kDa），以及识别P-Tau（Ser396/S404）的内部单克隆抗体4E7-1（图7B），中间）。在这里，用OA处理的细胞都被回收、裂解和分析。总Tau免疫印迹（DA9）显示，OA诱导单体tau蛋白显著减少，而寡聚体Tau蛋白种类增加。BW1c的存在剂量依赖性逆转了这些影响，而随机序列DNA无效（图7B，顶部）。
图7. 功能性Tau核酸适体BW1c的基于神经细胞的表征。
作者还怀疑这些OA诱导的高分子量低聚体形式的Tau主要含有磷酸化Tau。使用P-Tau（Ser396/S404）特异性小鼠单克隆抗体（4E7-1）进行免疫印迹，作者进一步证实OA处理确实产生了多个带段的P-TauMAb阳性单体和高分子量Tau寡聚物（图7B中，D）。重要的是，BW1c有效地将整体P-Tau带信号降低到接近基线水平，而随机序列DNA则没有。P-Tau抗体未检测到P-Tau的显着存在（图7D）。
9. 环状双特异性转铁蛋白受体-Tau核酸适体（TfR-Tau-核酸适体）的合成和表征
接下来，对BW1cTau核酸适体系列进行一些血液和大脑暴露研究。根据之前的研究，可以合成含有转铁蛋白受体结合核酸适体部分的环状双特异性核酸适体，以潜在地提高血浆稳定性并增强跨血脑屏障（BBB）门控脑血管内皮细胞的转吞作用。
10. 用单特异性BW1C-Cy5.5（BW）和双特异性BW1c-TfR-Cy5.5（BWT）Tau核酸适体处理小鼠
通过眼眶后静脉注射8.6 nmol标记的Cy5（BW）标记的核酸适体BW1c或标记Cy5.5（BWT）的环状双特异性BW1c-TfR核酸适体处理naïve和受控皮质冲击（CCI）的小鼠。图8显示了具有代表性的复合Cy5.5的荧光可视化，表明了BW和BWT核酸适体在naive和CCI后1小时的小鼠大脑中驻留。核酸适体给药后5小时，首先用PBS灌注动物，然后用多聚甲醛固定PBS灌注。大脑切片的Cy5.5信号表示，BW和BWT在大脑中渗透和驻留。与脑匀浆中的Cy5.5信号定量一致，BW和BWT在naive小鼠（图A和B，图8）和受CCI影响的小鼠（图C&D）的皮层和海马区域都显示出大量的脑渗透和细胞驻留。
图8. 示出了静脉注射Tau核酸适体BW或BWT5小时后获得的小鼠脑切片的Cy5.5荧光显微镜图像。
该体内数据集阐明了具有Cy5.5标记（BW）的环状核酸适体BW1c和具有Cy5.5标记（BWT）的环状双特异性BW1c-TfR核酸适体在幼稚小鼠和有创伤性脑损伤史的小鼠中能够穿越血脑屏障并浸润神经元和其他细胞类型的胞质区室。
与Tau蛋白病相关的神经系统疾病可能是由累积的Tau基因突变、脑损伤和代谢综合征引起的。在临床环境中，这些因素的特征是持续时间长和表型异质性。从分子病理学的角度来看，据报道，在正确的病理生理条件下，细胞内Tau蛋白及其过度磷酸化形式容易寡聚化。随着时间的流逝，Tau低聚物进一步形成大的蛋白质聚集体，这些聚集体通过干扰正常的细胞功能而变得神经毒性。因此，抑制Tau的异常过度磷酸化和/或聚集为阿尔茨海默病和相关tau病提供了一个有前途的治疗靶点。
结论
作者以Tau寡聚化为例，应用“功能筛选”策略筛选有用的核酸适体的方法具有可行性。本研究的结果提供了一个框架，用于实现基于功能的核酸适体候选物的富集，靶向经历关键构象变化或修饰的各种细胞生物分子。
