NAT NANOTECHNOL丨使用 DNA 折纸精细调解CpG空间分布以增强癌症疫苗效果
大家好，今天给大家分享的是2024年3月发表在Nature Nanotechnology上的“Fine tuning of CpG spatial distribution with DNA origami for improved cancer vaccination”。
癌症疫苗的核心在于通过识别抗原递呈细胞（APCs）表面的模式识别受体如Toll样受体（TLRs）来激活免疫。CpG寡核苷酸是一类重要的TLR9配体，能够通过未甲基化的CpG序列与TLR9结合，从而激活APCs并增强抗原特异性免疫反应。用纳米粒子呈递多拷贝数的CpG分子是疫苗佐剂开发中的常见手段。然而现有的纳米粒子不能实现CpG分子空间排布的精准控制，优化的CpG空间排列对于提高免疫反应的强度、持续时间和极化具有重要意义。
针对以上问题，美国哈佛大学的William Shih团队和韩国科学技术院的Ju Hee Ryu团队合作，开发了一种名为DoriVac的肿瘤疫苗开发方法——以DNA折纸为平台，精确调控佐剂分子CpG寡核苷酸（CpG ODNs）的排布以增强癌症疫苗疗效。利用结构DNA 纳米技术的优势，作者研究了不同纳米间距（2.5 nm - 7.0 nm）的CpG诱导的Th1极化免疫应答，并探索了不同CpG空间排布的DoriVac对癌症的治疗效果。结果表明具有最佳空间构型CpG（3.5 nm间距和18个CpG）的DoriVac可增强树突状细胞激活、抗原交叉呈递和T细胞激活的能力，且在与抗PD-L1药物联合使用中表现出显著的协同抗癌效果，并诱导了长期T细胞记忆。
DoriVac以方形晶格（SQB）的DNA折纸为核心组件。作者首先在SQB DNA折纸上设计了多种不同CpG间距的DoriVac，分别是间距为2.5、3.5、5.0和7.0 nm的CpG1、CpG2、CpG3和CpG4，并通过包被K10-PEG5k提高了它们的稳定性。作者发现，与相同摩尔量的SQB-CpG相比，游离CpG具有更强的细胞毒性，SQB共同递送抗原和佐剂显著增加了抗原摄取，DoriVac可有效进入BMDC，在共聚焦成像中，DoriVac与晚期胞内体共定位（图1）。
图1 制备具有不同CpG间距的SQB-DNA折纸疫苗
作者评估了CpG间距对树突状细胞(DC)的影响，包括小鼠BMDCs、人浆细胞样树突状细胞（pDCs）、单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）和小鼠RAW264.7巨噬细胞。结果表明，CpG间距为3.5 nm时（CpG2）能够显著增强BMDC的成熟和Th1极化免疫反应，且DoriVac处理组的CD40和DEC-205表达上调。与游离CpG和OVA相比，DoriVac能够刺激BMDC产生更多Th1极化细胞因子。在pDC和moDC细胞中，CpG2组也诱导了最强的Th1极化。与疫苗中常用的脂质体纳米颗粒相比，DoriVac显著增强了CD11c、CD40、CD11b、PD-L1和CD103的表达，并使RAW264.7细胞上SIINFEKL MHC I的表达增加了12倍。 作者进一步对BMDC样本进行mRNA测序分析来证实上述结果，并且发现CpG2组的DC细胞的标志物（CD40、CD80、CD86和DEC-205）和MHC I分子（H2-K1和H2-K2）上调。这些数据结果表明，通过精确调控CpG间距，DoriVac疫苗能够有效诱导Th1极化免疫反应，这为癌症疫苗设计提供了新的策略（图2）。
图2 CpG在SQB DNA折纸上以3.5 nm的间距递送，增强DCs的活化并促进Th1极化的免疫应答
接下来，作者探究了DoriVac处理DC与OVA特异性OT-I和OT-II T细胞共培养是否可以诱发抗原特异性的CD4和CD8 T细胞反应。当联合递送抗原时，CpG2组表达干扰素γ的极化的CD4 T细胞显著增加，T细胞分泌的干扰素γ和IL-2显著增加，与CD8细胞的增殖增加相对应，另外，CpG2还通过激活CD8 T细胞增强肿瘤细胞杀伤。随后，作者探索了CpG二聚体的空间构型是否会影响受体的多聚化。结果表明CpG的空间构型和数目都会影响受体激活和随后的免疫极化，且CpG以3.5 nm的间距能够增强Th1极化的免疫应答和经DoriVac将抗原和佐剂共递送后可强烈刺激DCs的激活，含18个CpG的组抗肿瘤效果最好（图3）。
图3 具有不同CpG空间模式和密度的DoriVac诱导的DCs的T细胞激活，揭示了独特的抗肿瘤作用
为了探索DoriVac作为疫苗的潜力，作者通过体内荧光成像评估了其生物分布情况。结果显示，DoriVac主要聚集在距离注射部位最近的引流淋巴结（LN），其他淋巴结的含量很低。另外，SQB DNA折纸在两天内被肝脏和肾脏清除，在这个时间点几乎检测不到Cy5荧光信号，而肺和脾脏仅分别在2小时和4小时显示较小的Cy5信号增加。作者通过在幼鼠体内注射DoriVac证实了优化的空间排布（CpG2，3.5 nm间距和18 CpG）可以极大地增强DC的激活并增加CD8四聚体阳性细胞群的数量，而不增加免疫抑制调节性T细胞（Treg）。之后作者进一步探索DoriVac作为疫苗的潜力，结果表明DoriVac在黑色素瘤小鼠模型中具有很强的肿瘤预防效果（图4）。
图4 DoriVac分布、体内免疫细胞刺激和预防性疫苗接种效果
接下来，作者在黑色素瘤小鼠模型中评估DoriVac的治疗作用，并通过应用新抗原进一步评估了DoriVac的治疗效果。结果表明具有最佳CpG构型（3.5 nm间距和18个CpG）的DoriVac CpG2可通过调节一系列的免疫细胞，在肿瘤中引导Th1极化的免疫应答；与未经治疗的对照组相比，携带新抗原的DoriVac组诱导了显著的肿瘤抑制。DoriVac可以作为一种安全、有效的通用平台，用于呈递各种新抗原以增强抗肿瘤功效（图5）。
图5 免疫细胞分析图谱揭示了小鼠黑色素瘤模型在接受DoriVac治疗后出现了Th1极化免疫反应
在观察到DoriVac治疗组的淋巴结树突状细胞上PD-L1表达升高后，作者认为DoriVac与免疫检查点抑制剂相结合将进一步增强治疗效果。结果表明，在B16-OVA黑色素瘤小鼠模型中，DoriVac与αPD-L1联合使用显著抑制了肿瘤生长，并促进了五分之四的小鼠肿瘤消退，四只肿瘤消退的小鼠都存活了下来，没有复发的迹象，并且在EG7-OVA淋巴瘤肿瘤模型中，DoriVac效果更好，没有小鼠死亡。此外，对6个月后存活小鼠脾细胞和外周血单核细胞的ELISpot检测结果显示，应用DoriVac的小鼠组具有长期持久的CD4和CD8 T细胞记忆。这些结果表明，DoriVac均可诱导先天性和适应性免疫细胞激活以及持久的T细胞应答的能力，并与免疫检查点抑制剂协同作用，进一步改善癌症的免疫疗效（图6）。
图 6 DoriVac与免疫检查点抑制剂抗PD-L1组合表现出协同、持久的T细胞反应。
本研究通过精确控制CpG ODNs在DNA折纸上的间隔，成功增强了癌症疫苗的免疫效果，特别是在诱导Th1极化免疫反应方面。3.5 nm间隔的CpG ODNs表现出最佳的免疫激活效果，为未来癌症疫苗的设计提供了重要参考。在未来，DNA折纸术有望进一步应用于多种疫苗和免疫治疗领域，通过精确调控佐剂和抗原的空间排列，实现更高效、更安全的免疫应答。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41565-024-01615-3
