PNAS│开发出针对肿瘤联合化疗多药耐药逆转的核酸适体

今天分享的是发表在PNAS上的一篇文章，题目为Development of an aptamer capable of multidrug resistance reversal for tumor combination chemotherapy.

作者介绍：

    文章的通讯作者是湖南大学的刘剑波教授，他的主要研究方向是人工细胞的化学构建和应用研究以及纳米与分子尺度水平上的化学生物分析。

研究背景：

肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，而肿瘤细胞的多药耐药(MDR)已成为HCC化疗失败的主要原因之一。肿瘤多药耐药是指在一种药物作用于肿瘤细胞而产生耐药性后，肿瘤细胞对未接触过的、分子结构和作用机制各不相同的其他化疗药物也产生交叉耐药的现象。而开发一种特异性的多药耐药逆转核酸适体可以促进药物在细胞内的积累，有效改善肿瘤治疗（图1）。该工作证明了核酸适体作为肿瘤多药耐药逆转剂的可行性，且所选核酸适体与化疗药物联合使用在治疗肝癌方面显示出巨大的潜力。

图1.核酸适体介导的肿瘤多药耐药逆转示意图

结果与讨论：

1 多药耐药细胞核酸适体的筛选

首先，采用cell - SELEX技术，以DOX耐药的人肝癌细胞系(HepG2 / DOX)为靶标，以其敏感的野生型(HepG2)为对照细胞，进行核酸适体筛选（图2A）。通过流式细胞术发现荧光强度在第13轮达到饱和点。于是对第13轮样品池进行高通量测序，选择了4个高度同源的序列(Seq1、Seq2、Seq7、Seq13)进行细胞结合实验，其中Seq1表现出对HepG2/DOX细胞的高选择性识别和对HepG2细胞的弱结合（图2B）。

      在对核酸适体Seq1的二级结构预测并对其截短后，共得到7个截短序列(d1~d7)，它们与HepG2/DOX细胞均具有明显的结合活性。其中，序列d3(50nt)的特异性最好（图2D）。

图2.多药耐药细胞的核酸适体筛选

2 核酸适体对靶耐药细胞的特异性识别

通过共聚焦荧光成像和流式细胞术研究了核酸适体d3对靶细胞的特异性识别能力。结果表明核酸适体(Cy5-d3)与HepG2/DOX细胞孵育，细胞周围可见明显的红色荧光，而随机序列(Cy5-RD2)则无明显的红色荧光（图3A-B）。流式细胞术测定了核酸适体d3的Kd=7.0nM（图3C-D）。

接着研究了核酸适体在细胞表面结合的靶标类型。通过流式细胞术评估了核酸适体d3与不同来源的表现出耐药性或敏感性的癌细胞的结合选择性。在相同条件下，d3可以识别多种耐药细胞，包括顺铂(CDDP)耐药肺癌细胞系A549 (A549/CDDP)、平阳霉素(PYM)耐药宫颈癌细胞系HeLa (HeLa/PYM)，但不识别药物敏感细胞，如A549和HeLa细胞（图3E）, 这些结果可以推测该核酸适体可能是与耐药细胞上的多药耐药通用靶点结合。

图3.核酸适体和靶耐药细胞之间的特异性识别

3 核酸适体d3识别的靶蛋白

通过基因敲低实验进一步确定靶蛋白是否与多药耐药蛋白相关，siRNA介导的转录后基因敲低，建立了稳定的MDR1‑、MRP1-、MRP2-、BCRP-、LRP‑敲低的HepG2/DOX细胞，并验证了其mRNA水平（图4A）。将基因敲低的HepG2/DOX细胞与Cy5-d3分别孵育。流式结果显示，与正常和阴性对照HepG2/DOX细胞相比，MDR1- HepG2/DOX细胞荧光明显减弱，而其它组未见明显荧光衰减（图4B）。因此，基因敲低结果表明MDR1可能是核酸适体d3的靶蛋白。

为了确定核酸适体与MDR1靶蛋白之间的识别位点，通过分子对接研究模拟了一个复合物三维结构，发现核酸适体d3通过静电和氢键相互作用与靶蛋白结合（图4E）。

图4.siRNA介导的基因敲低用于靶标鉴定

4 核酸适体介导的多药耐药逆转

      考虑到MDR1是核酸适体d3的靶蛋白，核酸适体结合可能能够抑制或增强靶蛋白的活性。因此，猜测当d3特异性结合细胞上的MDR1时，可能会阻碍MDR1的外排功能，从而逆转肿瘤细胞的耐药性。因此，为了验证d3是否抑制MDR1功能，将DOX与HepG2/DOX细胞在有无核酸适体d3的情况下分别孵育。结果显示，与不含核酸适体或随机序列处理相比，经核酸适体d3处理的HepG2/DOX细胞中DOX的积累增加了8.4倍（图5A-B），表明核酸适体d3与MDR1结合成功地改善了HepG2/DOX细胞内DOX的积累，并有效地逆转了它们的耐药性。

      接着通过MTT实验观察到（图5C），在核酸适体d3存在下，经DOX处理后，HepG2/DOX细胞的存活率和EC50均有约1.7倍的逆转（图5D）。为了直观评价核酸适体d3与DOX联合的体外治疗效果，用Annexin V-FITC和PI对细胞进行染色（图5E）。结果显示，与只有DOX(15.41%)或随机序列(RD2)与DOX联合(14.84%)相比，d3/DOX联合处理对HepG2/DOX细胞凋亡/坏死的诱导作用(38.99%)更为显著。

图5.核酸适体介导的多药耐药逆转

由于MDR1可以转运多种化疗药物，因此进一步研究了核酸适体d3介导的抗肿瘤药物VCR和PTX的药物积累和多药耐药逆转。结果表明核酸适体d3的逆转对VCR和PTX均有效（图6A-F）。说明核酸适体d3与MDR1结合可以减少HepG2/DOX细胞的药物外排，对MDR具有明显的抑制作用，从而增强药物积累，并以剂量依赖的方式促进HepG2/DOX细胞的凋亡。

图6.核酸适体介导的不同抗肿瘤药物的多药耐药逆转

5 核酸适体介导的多药耐药逆转用于肿瘤治疗

      为了评估核酸适体d3介导的多药耐药逆转的体内性能，建立了一种异种移植小鼠模型，将HepG2/DOX细胞植入小鼠大腿。然后经尾静脉注射Cy5标记的IT-d3（倒T修饰，增强核酸适体血清稳定性）后，肿瘤部位的荧光强度逐渐增强，在0.5 h后达到最大值，持续3 h（图7A）。并且IT-d3靶向并聚集于HepG2/DOX细胞形成的肿瘤内（图7B）。

      然后，通过5组实验证明了DOX/IT-d3的体内抗肿瘤效果。在核酸适体IT-d3存在的情况下，DOX处理的HepG2/DOX荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制率从49.3%下降到14.2%，与不添加核酸适体相比，MDR逆转了3.5倍（图7C-E）。并且结果表明IT-d3对照组组的小鼠的体重普遍略有增加，证明了IT-d3的生物安全性（图7F）。

图7.核酸适体介导的多药耐药逆转用于肿瘤治疗

总结：

      成功筛选并验证了一种抗多药耐药癌细胞的核酸适体d3，可靶向结合MDR1蛋白，逆转肿瘤多药耐药，增加细胞内药物积累，增强对肿瘤生长的抑制作用。实验验证了开发治疗性DNA核酸适体作为肿瘤多药耐药逆转剂的可能性，显示出进一步扩大核酸适体应用于精确诊断和靶向治疗的巨大潜力。