Mol Cell丨DDX21介导共转录RNA m6A修饰促进转录终止和基因组稳定

今天给大家分享的是近期发表在Molecular Cell上的一篇文章，题目是DDX21 mediates co-transcriptional RNA m6A modification to promote transcription termination and genome stability。

作者介绍：

本文的通讯作者是来自中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）的任捷研究员。目前课题组的主要研究方向包括：

1. 探索维护基因组稳定性的表观遗传机制，并将其应用于精准医学领域。
2. 研究RNA在干细胞和衰老过程中对染色质的调控作用。
3. 开发多维组学方法和单分子测序技术，以全面分析表观遗传学和基因组功能。

背景介绍：

RNA在转录后的修饰过程中，N6-甲基腺嘌呤（m6A）的添加尤为关键。这种修饰不仅调控着mRNA的翻译过程，还参与了包括肿瘤发生在内的多种生命活动。m6A的形成是由甲基转移酶复合物（MTC）催化的，该复合物由METTL3、METTL14和WTAP等蛋白组成。MTC不仅负责在mRNA上添加m6A，还参与塑造其分布模式，特别是在终止密码子区域的富集。尽管大约一半的m6A修饰在RNA合成过程中就已经发生，但目前对于这一共转录修饰的上游调控因素和下游生物学效应的认识尚不充分。

DDX21是一种多功能的RNA解旋酶，能够与多种RNA底物结合，包括R-loop等结构。DDX21在多种生物学过程中发挥作用，其中包括RNA聚合酶II（RNAPII）介导的转录调控。在作者之前的研究中，已经阐明了m6A在转录终止过程中的作用，特别是5'-3'外切核酸酶XRN2的参与，这是一个关键步骤，它能够与RNAPII相互作用，促进转录RNA的释放。如果转录过程遇到障碍，可能会导致终止缺陷，引发读穿现象，而这种情况是否会导致DNA损伤，目前还是一个有待进一步研究的问题。

结果与讨论：

1. 鉴定DDX21作为RNA MTC蛋白的独立组分

首先，研究者通过共免疫沉淀（co-IP）实验证实了DDX21能够特异性地结合R-loop结构。为了进一步探索DDX21是否参与m6A修饰的形成，他们采用了HeLa细胞过表达甲基转移酶复合物（MTC）蛋白的全细胞提取物进行co-IP实验，并预先用DNase和RNase处理以去除DNA和RNA的干扰。实验结果表明，DDX21与MTC蛋白（包括METTL3、METTL14和WTAP）的相互作用是独立于DNA或RNA的（见图1的ABC部分）。随后，研究者通过体外的下拉实验（Pull-Down）进一步验证了DDX21与METTL3之间的直接相互作用（见图1D）。接下来，研究者深入研究了DDX21与METTL3结合所涉及的结构域。他们利用带有myc标签的METTL3与DDX21的不同截短体进行共免疫沉淀实验。研究发现，DDX21与METTL3的结合并不依赖于其解旋酶活性区域，而是依赖于其N端和C端的非活性区域（见图2E）。

图 1 DDX21与MTC蛋白的结合

图 2 DDX21与METTL3的结合结构域分析

2. R-loop和DDX21介导了METTL3的染色质募集

首先，通过caPAR-CLIP-seq技术，研究者发现DDX和METTL3所结合的未修饰新生转录本具有高度的重叠性（见图3.A）。此外，ssDRIP-seq技术检测到的R-loop信号在DDX21和METTL3的结合位点周围显示出相似的富集水平（见图3.B）。caPAR-CLIP-seq所确定的DDX21和METTL3的结合位点与ssDRIP-seq所测定的峰值区域存在共定位现象（见图3.C）。进一步的实验中，研究者通过过表达RNaseH来消除R-loop结构，随后进行caRIP-qPCR检测，结果显示DDX21和METTL3与caRNA的结合位点的关联性显著降低。这一发现表明R-loop结构为DDX21和METTL3的招募至caRNA提供了锚定点（见图3.D和E）。接下来，研究者通过shDDX21、shMETTL3以及过表达RNase的实验方法，观察到敲低shDDX21后，METTL3结合的caRNA数量减少；而敲低METTL3对DDX21结合caRNA的影响不显著（见图4.F和G）。这种模式同样反映在结合强度上（见图4.H）。此外，通过体外构建带有生物素标记的R-loop并进行共免疫沉淀（co-IP）实验，进一步证实了R-loop首先与DDX21结合，随后促进METTL3的招募。综上所述，这些结果表明R-loop在DDX21和METTL3的招募过程中起到了关键的中介作用。

图 3 R-loop参与caRNA招募 DDX21和METTL3

图 4 R-loop先招募DDX21，再结合METTL3

3. DDX21通过解旋酶活性促进m⁶A修饰caRNA

首先，研究者通过过表达RNase进行斑点印记实验，观察到caRNA上的m6A修饰水平有所下降（见图5.A和B）。同时，通过敲低DDX21并进行甲基化RNA免疫沉淀实验，发现整体m6A水平也有所降低（见图5.C）。这些结果表明，R-loop和DDX21在介导METTL3的招募过程中发挥着至关重要的作用，这是下游甲基化反应所必需的。接着，研究者发现DDX21的无解旋酶活性突变体虽然能够招募METTL3，但却无法恢复m6A水平。为了进一步探究DDX21的解旋酶活性对m6A修饰的影响，研究者设计了两种突变体DDX21SAT和DDX21DEV，并进行了斑点印记实验。实验结果证实，DDX21的解旋酶活性对于m6A修饰的形成是必不可少的（见图6.F、G和H）。

图 5过表达RNase和shDDX21对m⁶A的影响

图 6 DDX21的解旋酶活性参与了m⁶A形成

4.DDX21和METTL3促进XRN2介导的RNAPII转录终止

首先，研究者观察到DDX21能够增强m6A在转录终止位点（TES）的富集，而降低DDX21的表达则会导致m6A富集减少（见图7.D）。基于这一发现，研究者选取了ACTB基因，运用meRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀测序）和ChIP-qPCR（染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应）技术进行分析。结果显示，在RNA聚合酶II（RNAP II）的暂停位点，DDX21和METTL3都显著富集，并且METTL3的富集依赖于DDX21的存在（见图7.A、B和C）。

接着，研究者利用原生延伸转录组测序（mNET-seq）技术来检测RNAP II的转录过程，发现当DDX21或METTL3的表达被降低时，会出现转录终止的缺陷（见图8.D和E）。通过CRISPR干扰（CRISPRi）技术，研究者确认了这些延长的转录本确实是由于基因转录终止过程受到阻碍，而非来自下游的启动子（TSS）。最终，研究者使用了一种外切核酸酶XRN2，它能够与R-loop、METTL3和DDX21结合，并能靶向RNAP II以释放RNA。利用ChIP技术追踪RNAP II，研究者发现缺少任何一个元素都会导致XRN2在终止区域的富集减少，并且伴随着读穿现象的发生（见图8.F、D和H）。

图 7 ACTB基因中，DDX21和METTL3富集在pause位点上

图 8 R-loop、METTL3、DDX3任一缺失会减少XRN2富集并出现读穿现象

5.DDX21-METTL3-m⁶A轴通过促进转录的有效终止减少DNA损伤

首先，研究者采用了γH2AX作为指标来评估DNA损伤的程度。通过shDDX21/shMETTL3进行γH2AX ChIP实验，他们发现当DDX21或METTL3的表达被抑制后，γH2AX会在基因的读穿位点大量积累（见图9.B、C和D）。此外，使用RNA聚合酶II（RNAP II）的抑制剂DRB处理细胞，可以降低γH2AX的水平，表明RNAP II活性与DNA损伤有关（见图9.E）。进一步地，研究者评估了该轴上各个组成元素在不同阶段的参与情况，发现缺少任何一个元素都会导致DNA损伤的发生。这些结果强调了DDX21-METTL3-m6A轴在防止DNA损伤中的关键作用（见图10.F、G、H和I）。

图 9 shDDX21、shMETTL3处理引起细胞损伤

图 10 DDX21-METTL3-m⁶A轴通过促进转录的有效终止减少DNA损伤

总结

本研究深入探讨了共转录过程中m6A修饰的形成及其生物学功能，提出了一种创新的分子机制，该机制不仅调控了转录过程，还对维持基因组的稳定性起到了关键作用。