JACS丨用于可逆、连续控制 DNA 链置换动力学的即插即用模块

本次给大家分享的是发表在Journal of the American Chemical Society 上的一篇文章，题目是Plug-and-Play Module for Reversible and Continuous Control of DNA Strand Displacement Kinetics

作者介绍

文章的通讯作者是四川大学的李峰教授，课题组主要从事DNA技术的开发和应用，聚焦于动态DNA纳米技术的新组成、DNA纳米技术和纳米材料的结合以及床边检测的新型诊断平台开发。

目前课题组的研究方向主要包括：

①引入DNA链置换反应的新概念和策略，丰富当前的动态DNA纳米技术工具箱。

②将动态DNA纳米技术与纳米材料相结合，制造纳米尺度上具有明确功能的3D机器和设备。

③开发下一代床旁检测新型诊断平台。

背景介绍

在细胞和各种化学反应过程中，精准的化学反应网络 （CRN） 可以对各个步骤进行调控，通过众多调控模块和信号通路对 CRN 进行精确的时间控制在维持细胞功能和稳态方面等方面起着至关重要的作用。从根本上讲，CRN的时间控制依赖于对每个基本构件的化学动力学的精确调节。而Toehold 介导的 DNA 链置换反应 （TMSD） 是CRN 中使用最广泛的构建单元之一。但是目前已有的控制模块都是被直接加入到 TMSD 中，这造成了不可逆的结构，从而难以集成到现有的基于 DNA 的 CRN 中。因此，目前缺少一种能够满足非平衡CRN和持续控制CRN时间的理想动力学调控模块。

李峰教授课题组开发了一种即插即用的DNA链置换反应动力学调节模块Antitoehold（At）。根据设计原理，At具有很多优势：

1. At作为独立组件，可灵活集成到目标CRN中，同时彼此序列信息互不干扰；
2. 可以实现快速可逆调控，实时地激活和停用。
3. 通过简单的浓度控制完成动力学精细且连续的调节。

结果与讨论

1. At的理论设计

由于toehold对接通常是TMSD的限速步骤，阻断这个区域可以有效改变TMSD的动力学。At通过占据双链底物的toehold区域，形成亚稳态的CPAt三链复合物，进而实现对动力学的调控。设计同时考虑了碱基配对和碱基堆积，以在At和CP之间提供足够的亲和力，形成亚稳态复合物（图1a、b、c）。

首先，通过在双链底物的结构域a*和b*之间引入1个碱基堆叠位点，有效地将TMSD反应V_max从3.3×10^-11降低到4.2×10^-13 M/s，成功地低了2个数量级。引入第二个碱基堆叠位点后，V_max进一步降低到1.4×10^-13 M/s ，相对于引入1个堆积位点降低了3倍（图1d、e、f）。

除了碱基堆积位点的数量外，碱基堆积的类型也可以用于调整TMSD的动力学，在相同的实验条件下，A-A堆叠的效率是C-A（或T-A）堆叠的四倍（图1g、h）。但是其他参数，比如利用线性DNA取代发夹结构、碱基堆积的方向以及茎和环结构域的长度等对At的性能影响不大。

图1. At的设计原则

2. At调控的理论模型

利用计算机模拟讨论了At调控的理论模型，推测可能是toehold占据引起的速率调控。由于 CPAt 是亚稳态的，因此 CPAt 与解离的 CP 和 At 之间存在平衡。加入入侵链 T 后，随后的链位移通过两种途径传播（图 2a），包括 T 和 CP 之间的反应和 T 以及CPAt 之间的直接置换。同时发现改变At浓度能显著影响反应速率（图2b）。

图2. At调控的理论模型和浓度调控

3. At连续且可逆地调控TMSD

与传统调节 TMSD 动力学方法的显著不同在于At 是一个附加组件，能够适应任何现有的 TMSD，无需重新设计双链或入侵序列。At也可以用作TMSD动力学的细粒度和连续调控的参数。即At浓度越高，抑制TMSD动力学效果越强，改变toehold长度也可以控制TMSD动力学（图3a、b）。

为了实现对 TMSD 动力学的可逆控制，进一步设计了抗 At 的模块anti-At，该结构体通过和At的 a* 和 c* 稳定结合，形成双链体，消减At对TMSD的作用（图3c）。实验动力学曲线表明，是否提前预孵育At，都可以实时调节 TMSD 动力学（图3d）。通过向实验体系中定时补加anti-At模块的操作，进一步揭示了通过CPAtanti-At和T之间的协同杂交能够有效地实时恢复TMSD动力学（图3e）。

图3. At连续且可逆调控TMSD

4. At调控具有正交性

在证明了使用 At 对单个 TMSD 的动力学调节之后，接下来验证了 At 在包含多个 TMSD 反应的系统中的性能。向三个不同的TMSD反应提供单个At，发现只有当At和CP双链体之间的序列完全匹配时，才会发生动力学控制。这些结果证实，At与TMSD反应高度正交，可以独立添加到基于TMSD的CRN中，而不必担心交叉反应（图4a、b、c）。

在反应体系中使用两组 Ats 对两个 TMSD 反应的并行调节，,进一步证实了At可以独立工作，不影响其他反应动力学性能（图4d、e、f）。

图4. At对多个TMSD反应进行正交调控

5. At调控脉冲生成CRN

将 At 添加到到现有的基于 TMSD 的 CRN 中可能会改变一个或多个目标构建模块的动力学行为，从而实现 CRN 的时间控制。

设计了一个脉冲生成 CRN 系统，其中两条侵入链（I₅和 I₃）竞争相同的 CP 双链体，I₅和I₃分别用 FAM/淬灭剂和 ROX/淬灭剂对标记。ssDNA链的柔韧性，荧光基团可以被淬灭剂有效地淬灭。和CP结合杂交后，刚性双链结构将荧光团与淬灭剂分离，从而开启荧光（图5a）。通过将 At 直接添加到这种竞争体系中，发现在 ROX 通道上实现了脉冲产生行为，表明 ROX 标记的 I₃C 的产生速度明显快于 I₅C（图5b、c）。

At是一个附加模块，通过改变At的浓度进一步微调脉冲产生的动力学行为。通过将At的浓度从0 nM改变到1μM，实现了具有变化幅度和宽度的荧光脉冲，显示At调控方法的灵活性（图5d、e）。

图5.  At调控脉冲生成DNA CRN

6. At调控核酸探针的选择性以及亲和性

At 作为一种动态方法，用于调整基于toehold的 DNA 杂交探针的亲和力和选择性，进一步增强其区分单核苷酸突变（SNR）的能力。在计算机模拟当中发现At作为辅助，可用于微调探针的敏感性和特异性以区分突变，将探针的特异性提高了2.6倍，而不会显着影响亲和力（图6a、b）。

通过实验验证At在调整杂交探针的亲和力和特异性方面的潜力，设计了一种toehold交换探针，用于区分突变。加入At特异性明显提高，同时也进一步证明了At对1nM至1μM不同浓度、不同位置的的靶序列有效（图6c、d、e）。

图6 . At微调DNA杂交探针的亲和性和选择性

总结

总而言之，At作为TMSD工具箱的全新补充，为其动力学的可逆和连续控制提供了高度灵活的即插即用模块。由于At是一个附加模块，不需要重新设计任何序列，能应用到任意现有的基于TMSD的CRN中，从而达到对动力学的调控效果。同时，At也为设计连续可调的DNA杂交探针提供了一种新的方法，这可能会在区分临床上重要的SNV方面找到实际应用。

文献信息：

Wu, Lang, Guan A. Wang, and Feng Li. "Plug-and-Play Module for Reversible and Continuous Control of DNA Strand Displacement Kinetics." Journal of the American Chemical Society (2024).