J. Am. Chem. Soc. | RNA凝聚物用于提升RNA荧光适体性能和细胞成像
今天分享的是2024年2月发表在J. Am. Chem. Soc.上的一篇文章，标题为RNA Condensate as a Versatile Platform for Improving Fluorogenic RNA Aptamer Properties and Cell Imaging.
有关作者：
本文的通讯作者之一为来自南京理工大学的任克维教授，其研究方向为细胞和活体内生物分子成像、细胞调控与药物智能载运系统等。
研究背景：
RNA荧光适体可以选择性结合小分子荧光团并提高其荧光信号，因其体积小、特异性高、可编程和背景信号低等优点被成功应用于细胞成像，其分析靶标包括信号分子、代谢物和RNA等。然而，基于荧光RNA适体的生物传感系统受限于其抗酶解能力、光稳定性以及荧光提升程度。
RNA适体的功能和活性取决于结构，而拥挤环境可以提高RNA结构的稳定性、活性和抗酶解能力。拥挤环境对RNA性能的提升已被应用于人工细胞中，但仍未在天然细胞中实践。
在本工作中，作者利用CUG三核苷酸重复序列形成的凝聚物在体外和活细胞内创造拥挤环境，使得RNA荧光适体表现出更高的抗酶解能力以及荧光信号强度，并且实现了细胞内靶标的高效检测。
设计：
作者开发了FLuorogenic Aptamer-based RNA condensatE (FLARE)成像系统（图1）。 该系统包含CUG重复序列（蓝色）和荧光适体（红色）两部分，其中CUG重复序列触发相分离并将RNA荧光适体招募进入凝聚物中提升其靶标亲和力以及光物理性质。作者还进一步将FLARE与靶标识别适体（黑色）融合，构建FLARE sensor (FLARES)以实现细胞内靶标的检测，提高抗酶解能力和信号强度。
图1. FLARES用于细胞成像。
实验结果：
作者首先在体外表征了FLARE。他们将CUG重复序列分别与Broccoli、Pepper和Corn三种荧光适体融合，在聚赖氨酸的存在下，RNA发生相分离形成带荧光的凝聚物（图2a）。在凝聚物中，荧光适体表现出相较于游离状态更高的热稳定性（图2b）、抗酶解能力（图2c）、光稳定性（图2d）以及底物亲和力（图2e）。上述结果表明，FLARE中的分子拥挤环境和静电作用提高了RNA荧光适体的热稳定性和折叠效率。
图2. 体外表征FLARE。（a）共聚焦表征凝聚物形成；（b-e）比较凝聚物和游离状态的RNA适体对温度、RNase A、光照和荧光底物的响应。
在体外观察到凝聚物对RNA适体性能的提升后，作者从荧光强度、抗酶解能力和光稳定性三方面在活细胞中表征FLARE。他们在E. coli中表达31×CUG标记的荧光适体（FLARE），以无CUG标记（不发生相分离）的适体作为对照（0-CUG），发现Broccoli、Pepper和Corn的荧光信号在FLARE中分别提升了2.2，2.7和3.5倍（图3a）。在移去诱导剂IPTG 24小时后，FLARE仍保持原有荧光强度的~45%，而表达0-CUG体系荧光则降至<25%（图3b），表明凝聚物中的RNA适体具有更高的生物稳定性。对于光稳定性，作者对E. coli进行持续光照，发现FLARE表现出更慢的荧光衰减，表明FLARE仍能在细胞中提高RNA适体的光稳定性。
图3. 在E. coli中表征FLARE。凝聚物对RNA荧光适体（a）荧光强度、（b）抗酶解能力以及（c）光稳定性的影响。
在证明FLARE在细胞内的优越性后，作者将带有corn适体的FLARE与S-Adenosylmethionine (SAM)适体融合，测试其对特定靶标的检测能力。在体外实验中，FLARES表现出比溶液状态低4倍的EC50（图4a），该现象归结于RNA凝聚物拥挤环境对corn二聚的促进作用。在SAM浓度为0.05至1000 μM范围内，FLARES的荧光强度与SAM浓度呈正相关（图4b），表明FLARES能用于检测生理条件下的SAM。在细胞实验中，FLARES的荧光强度为游离RNA体系（FS-Sensor）的4倍（图4c），且其信号受到SAM合成抑制剂cycloleucine调控。相比之下，不含SAM适体的FLARE和游离的corn适体对cycloleucine均无响应。上述结果表明，带有SAM适体的FLARES能够实现细胞内SAM水平的检测，且相较于不含CUG的传感器具有更高的效率和灵敏度。
图4. 利用FLARE构建（a）体外和（b）细胞内SAM传感器。
为了证明FLARES的普适性，作者又将31×CUG与之前报道的基于pepper的tetracycline传感器相融合，构建针对tetracycline的FLARES。在优化的聚赖氨酸浓度下（图5a，d），FLARES的荧光信号与0.1-100 μM范围内的tetracycline呈正相关（图5b，e）。在E. coli中，tetracycline FLARES（T-FLARES）信号随tetracycline浓度变化，且相较于游离的传感器（FT-sensor）表现出更高的荧光强度和信噪比（图5c，f）；相反，不含tetracycline的游离pepper（F-Pepper）和FLARE则对tetracycline浓度变化无响应。上述结果表明FLARES能够作为通用性平台实现不同靶标的体外和细胞检测。
图5.（a, b, d, e）体外和（c, f）细胞内表征针对tetracycline的FLARES。
最后，作者在哺乳动物细胞中表征FLARE和相应传感器的性能。表达72×和121×CUG FLARE（FLARE-72和FLARE-121）的HEK293T细胞相较于表达31×CUG的FLARE（FLARE-31）和游离corn（F-corn）的细胞表现出更大、更亮的荧光斑点（图6a-b）。将FLARES改造为SAM传感器（S-FLARES-72/121）后，相应细胞表现出荧光斑点，且其荧光强度受到cycloleucine（抑制SAM合成）和SAHA（上调SAM水平）的调控（图6c-d）。相反，在表达游离传感器（FS-Sensor）的细胞则未观察到荧光斑点。上述实验说明基于FLARES的传感器可用于哺乳动物细胞内的靶标成像。
图6.在HEK293T细胞中表征（a-b）FLARE和（c-d）基于FLARES的SAM传感器。
总结与展望：
在本工作中，作者开发了基于RNA凝聚物改进RNA荧光适体性能的方法（FLARE）。在凝聚物的拥挤环境中，RNA适体表现出更高的抗酶解能力、热稳定性、光稳定性和底物结合能力。此外，作者还进一步将FLARE与SAM/tetracycline适体融合，实现了细胞内特定靶标的高效检测。相较于由蛋白凝聚物构建的传感器，FLARES具有更高的可编程性和普适性。此外，如果将荧光RNA适体替换为结合蛋白的适体，FLARE也可能用作细胞功能调节。
R. Ji, L. Wang, Y. Shang, S. Du, Y. Xiao, W. Dong, L. Cui, R. Gao, K. Ren, RNA Condensate as a Versatile Platform for Improving Fluorogenic RNA Aptamer Properties and Cell Imaging. J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 7, 4402–4411.
https://doi.org/10.1021/jacs.3c09162
