Nat Biotechnol| Programmable protein expression using a genetically encoded m6A sensor
今天分享的是一篇2024年1月2日发表在Nat. Biotechnol上的文章，题目是Programmable protein expression using a genetically encoded m6A sensor。
通讯作者：
杜克大学医学院生物化学系的Kate D. Meyer教授的主要研究方向包括m6A的产生机制、可视化检测等。同时她也在RNA修饰、RNA-蛋白互作以及RNA剪接方面有所涉及，其中以mRNA为主。
研究背景：
m6A是mRNA中最常见的修饰，它对mRNA的剪接、翻译、半衰期等都有影响。m6A对许多生理过程都有调节作用，例如m6A可以帮助细胞更精准的响应细胞外的刺激，从而更精准的调节基因表达。m6A表达水平的异常会导致许多疾病，例如心血管疾病、癌症以及神经退行性疾病。
目前常见检测m6A的手段包括使用m6A抗体、薄层分析法和质谱，但上述方法均存在一些共性缺点，例如需要大量RNA样本进行检测、处理步骤过多以及无法区分m6A与m6Am等问题。其中m6A抗体还存在非特异性问题；薄层分析依赖于放射自显影进行检测，存在放射性问题；质谱分析依赖于相关仪器进行监测分析，成本较高。因此，本文的作者旨在开发一种在活细胞中高通量检测m6A的方法。
m6A传感器的设计与可行性检测：
本文作者曾开发过一种基于测序的方法检测m6A状态，名为DART-seq（NATUE METHODS, 2019, 16）（图 1）。其中YTH是m6A结合蛋白，可以特异性识别m6A位点。APOBEC1是一种胞嘧啶脱氨酶，可以靶向DNA和RNA，诱导胞嘧啶向尿嘧啶的变换。通过将YTH与APOBEC1融合，可以实现对m6A邻近的胞嘧啶进行编辑，将其变为尿嘧啶，再通过测序可以实现对m6A状态的检测。由于YTH无法识别m6Am，所以可以区分m6A与m6Am。同时该方法仅需10 ng样本即可实现检测。
图1. DART-seq的原理图。
上述方法虽然大幅改进了现有技术对m6A的检测，但是结果读出不直观。在本研究中作者开发了一种遗传编码的m6A传感器——GEMS（genetically encoded m6 A sensor）(图 2）。因为DART-seq系统中可以实现C到U的变化，作者考虑到可以通过让终止密码子提前的方法，改变荧光蛋白的状态，实现m6A结果的读出。作者将EGFP与DHFR融合，其中DHFR是一种降解子，可以通过泛素途径降解蛋白质。在连接序列中，作者设计了CGA和CAG两个密码子，通过YTH对其中m6A的识别，使得m6A临近的C变为U，将两个密码子变为终止密码子，从而提前终止翻译仅表达EGFP。因此，在不存在m6A的情况下，会完整表达EGFP-DHFR融合蛋白，导致EGFP被降解，没有荧光产生；在存在m6A的情况下，由于终止密码子提前，仅表达EGFP，产生荧光。综上，存在m6A的时候有EGFP荧光，不存在m6A的时候没有EGFP荧光，该方式简化了m6A状态的读取。
图2. GEMS的原理图。
首先作者验证GEMS系统的可行性，通过比较转入EGFP-DHFR和共转EGFP-DHFR与APO1-YTH，确认GEMS可以识别传感器上的m6A状态（图3a-c)。并通过突变YTH的方式，证实了该系统对传感器上m6A状态的检测源于YTH对传感器上m6A位点的识别(图3d-f）。作者对比传感器序列与细胞内源ACTB对应区域的m6A情况，发现二者甲基化程度接近，说明传感器序列上m6A程度代表了细胞内m6A程度（图3g）。
图3. GEMS系统的可行性验证。
接下来，作者试验该传感器可否检测细胞内甲基化环境。作者挑选了甲基转移酶METTL3进行检测。首先，作者将METTL3与生长素诱导降解标签偶联。加入生长素后，METTL3降解，m6A程度低，EGFP荧光强度弱。作者将GEMS系统与METTL3共转入细胞，通过比较加与不加生长素后细胞内EGFP强度、蛋白表达量、碱基编辑比例，证实EGFP强度可以反映体系内METTL3的表达强度（图4a-e)。然后，作者过表达了METTL3，并通过GEMS进行检测，通过与正常表达的体系进行比较，证实GEMS可以检测METTL3过表达所导致的m6A水平升高（图4f-j)。
图4. GEMS系统的响应可以反映体系内METTL3的表达水平变化。
由于体系内抑制转录、翻译或荧光蛋白产生的因子可能导致结果存在偏差，因此作者引入了一个内参荧光蛋白DsRed。为了验证该GEMS体系的普适性，作者分别在HeLa、HEK293T与Huh7细胞中进行检测，得到的m6A程度与该细胞甲基化程度相符，证明该体系可以用于不同细胞甲基化程度的检测（图5）。
图5. GEMS系统可以用于不同细胞内m6A水平的检测。
作者还发现，GEMS系统可以用于检测METTL3的抑制剂。已知STM2457是METTL3的抑制剂，作者利用GEMS系统分别测定加入与未加入STM2457的体系中EGFP的强度、蛋白表达量与碱基编辑比例，证实该体系可以用于检测METTL3的抑制剂（图6）。
图6. GEMS系统可以用于筛选METTL3的抑制剂。
最后，为了不仅识别体系内甲基化环境，还可以根据环境产生不同的生物功能。作者将EGFP更换为SOCS2，并分别将GEMS-EGFP与GEMS-SOCS2导入细胞，通过比较二者碱基编辑比例、蛋白表达情况与对STM2457的响应情况，证实更换为功能蛋白后不影响GEMS系统的正常功能（图7a-e）。由于SOCS2会作用于JAK-STAT通路，因此作者对下游通路蛋白的表达与磷酸化状态进行检测，证实借由系统表达的SOCS2可以正常发挥生物功能（图7f-h）。对细胞状态的观察也证实了上述观点（图7i）。为了可以对癌细胞有更普适性的抑制作用，作者将SOCS2更换为p53蛋白。借由类似方法验证，证实表达的p53可以正常发挥生物功能，且仅对过甲基化状态的细胞有明显抑制作用，说明GEMS系统可以作为一种普适性方法抑制肿瘤细胞生长（图7j-k）。
图7. GEMS系统中的EGFP可以更换为其他功能蛋白发挥生物功能。
结论：
- GEMS系统可以用于检测多种细胞的甲基化状态及其动态变化水平，并以荧光信号的形式读出。
- GEMS系统可以用于监测METTL3表达水平变化，筛选发现其抑制剂。
- GEMS系统中的荧光蛋白可以用其他具有生物功能的蛋白进行替换，发挥更多功能。
