ACS Nano丨用于聚合酶驱动的 DNA Kirigami的预先绘制的 DNA Origami画布
大家好，今天给大家分享的是2023年8月发表在ACS Nano上的“Presketched DNA Origami Canvas for Polymerase-Driven DNA Kirigami”。
通讯作者：
潘林强，华中科技大学自动化学院副院长、华中学者特聘教授。主要从事生物计算及其相关的纳米技术和人工智能研究和教学工作。
徐飞，华中科技大学人工智能与自动化学院，副研究员。研究方向包括生物计算、DNA计算、DNA纳米技术等。
研究背景：
本文的研究背景是DNA kirigami的改进。DNA kirigami是一种通过切割和重组DNA结构来创建新的形状和图案的技术。然而，传统的DNA kirigami方法例如立足点介导的链置换(TMSD)反应和该课题组之前工作中使用的聚合酶引发的链置换（PTSD）反应，它们存在一些限制，如切割不精确和效率低下。因此，研究人员提出了一种新的策略，即使用预设计的DNA origami画布（PS_origami canvas）来改善DNA kirigami的精细度和效率。预设计的DNA origami画布通过在稳定的DNA结构中引入单碱基插入，使得切割和重组过程更加容易和精确。该文献旨在探索和验证这种新的DNA kirigami方法的可行性和优势。
Results and Discussion：
图1 构建预先绘制的 DNA 折纸画布的方案
研究人员以Rothemund的矩形DNA折纸作为构建预绘制DNA折纸(PS_origami) 的例子，为了在DNA折纸上形成结构上松散的区域，他们在松散区域的staple中间插入了额外的胸腺嘧啶 (T)。图1a中灰线表示常见的staple链、蓝线表示支架链以及绿色单T凸起的红线表示松散固定的staple链。额外的T向平面外侧凸出，以避免挤压相邻的螺旋。计算机软件模拟表明，具有单T插入的局部双链的稳定性略低于未插入的双链，使得具有额外T的staple链更容易被移除。图1d是为了测试单碱基插入是否会破坏AFM图像中DNA折纸的结构，设计了一组预先设计的矩形折纸变体，其松散区域部署在折纸的不同位置。凝胶电泳结果中，RO1样品中的DNA折纸条带表现出与其他样品大致相同的迁移率，说明单碱基插入对DNA折纸的结构影响很小。此外，四种矩形折纸变体在凝胶图中的亮度相同，表明产量基本相同。最后，AFM图像中可以看到， RO1、RO2、RO3 和 RO4 样品具有完整的矩形结构，表明单T插入不会显着损坏矩形折纸的结构。
然后，研究人员研究了预绘制DNA折纸画布对提高DNA kirigami 精细度的影响。图2a显示了聚合酶驱动的DNA kirigami (PDK)的一个典型步骤，即DNA折纸上聚合酶引发的DNA链置换 (PTSD) 反应的步骤。红点表示具有悬垂的staple链的PTSD部位，绿点表示具有单T插入的延伸staple链的PTSD部位。图中，红线的3'端包含一个14个nt长的突出端，作为 PTSD 反应的立足点。引物与立足点结合并启动 PTSD 反应，引发链位移，从而从折纸结构中移除staple链。图2b在矩形切口区域中有两种延伸的staple链，即常规延伸的staple链和单T插入的延伸staple链；红色部分由常规延伸staple链折叠，而绿色部分由带有单T插入的延伸staple链折叠。图2c将矩形切口区域分为四部分，C后的数字代表着n个红色部分，S后的数字代表着m个绿色部分。通过对 AFM 图像进行定性分析，研究人员发现随着单T插入的增加，缺失的区域更加接近标准矩形；定量地，他们统计了不同样品中目标产物的数量，发现随着绿色部分的逐渐增多，产率也逐渐增大。这些结果表明，单碱基插入的区域提高了PDK的精细度和效率。为了进一步展示单碱基插入方法的多功能性，研究人员设计了四张预绘制的DNA折纸画布并将其转化为字母图案。通过AFM成像，可以观察到精细修剪的字母图案，进一步证明了基于预绘制纳米结构的PDK策略的可行性。
图2 预先绘制的DNA折纸作为PDK的二维画布
研究人员猜测画布上的两个因素影响PDK的效率：双链的稳定性和切割区域的柔韧性。NUPACK结果表明，单T插入稍微降低了双链的稳定性。在拆卸矩形切割区域的实验中，当切割区域没有单T插入时，只能拆卸高柔韧性部分（角上的红色三角形区域）；当低柔韧性部分被插入单T时，大量画布转化为目标产物。综上，单碱基的插入放松了staple和支架链的结合，并松开了不灵活的切割区域，使PTSD反应可以轻松地从切割区域精确地置换staple链，从而提高PDK的精细度。
图3 预先绘制的DNA折纸作为PDK的三维画布
接下来，研究人员为验证改进的PDK方法构建了一个三维预绘制莫比乌斯带状折纸画布。如图3a，他们选择向螺旋4、螺旋5 和螺旋6中的staple添加单碱基T插入，来构建切割区域。去除切割区域后，莫比乌斯带状折纸转变为超螺旋环结构。通过AFM图像可以观察到，修剪前，91%的纳米结构呈现莫比乌斯带形状，5%纳米结构呈现超螺旋环形状；PTSD反应后，莫比乌斯带和超螺旋环的百分比变为4%和88%。这说明了PDK对于三维预绘制莫比乌斯带状折纸是有效的。除了上述结构外，还验证了PDK在honeycomb lattices设计的三维预绘制DNA折纸上的适用性。研究人员采用了精灵瓶(GB)形状的经典三维折纸作为PDK的画布。该结构有两个区域：内部杆域和外壳域。内部杆域不会被修剪，而外壳域所有staple包含延伸的立足点，并插入了单碱基T。PDK反应后，外壳域将被分解，精灵瓶形状结构将转变为棒状纳米结构。透射电子显微镜的结果显示，在去除外壳域后，研究人员成功地将大部分精灵瓶状结构修剪成棒状结构，精灵瓶形状和棒状形状的比例从80%和13%变为9%与86%。为了概括PS_origami的设计策略，研究人员总结了两个简单的规则来指导单碱基插入的配置。第一个规则是“长staple链”规则，要求单碱基插入配置在长staple链上（长于24-nt，包含两个交叉和三个片段）；第二条规则是“远离接缝”规则，它要求单碱基插入配置在远离DNA折纸接缝的staple链上。
图4 用于定量表征PDK细度的预先绘制的 6HB 折纸画布
为了进一步研究改进的PDK方法的精细度和效率，研究人员构建了一个预绘制的6HB折纸，长度为 404 nm，其一端包含三个等长的切割亚基（每个是52 nm），可以将其修剪成一组具有预定义长度的较短纳米线。他们在不同的亚基中设计了三个不同的突出部分作为PTSD反应的立足点，三条引物链专门识别这些立足点以触发PTSD反应。通过分别添加引物1、引物1和2以及引物1和2和3，可以从最初的6HB-404调整到6HB-352、6HB-300和6HB-248。图4b可以观察到，随着更多的亚基被分解，TEM图像中纳米线的长度明显变短。图4c是不同纳米线的平均长度。为了估计基于预设计6HB折纸的PDK的效率，研究人员设置了95%和90%置信区间，并计算了不同长度在置信区间内的百分比。从图 4d中可以得出PDK的精细度和效率随着切割区域的增加而降低。于是猜测预设计6HB折纸内部区域有相对较大的空间位阻阻碍了PTSD反应的发生，从而降低了PDK的精细度和效率。
Conclusion：
本文是通过构建预绘制的DNA折纸画布，可以改善DNA kirigami的精细度和效率。通过在画布上引入单碱基插入，可以松弛切割区域，使聚合酶引发的链置换反应更容易进行。实验结果表明，单碱基插入可以松弛切割区域，但不会显著破坏折纸结构的构象。同时，PDK方法允许研究人员仅使用一种引物序列便可将相同的DNA折纸画布转化为不同的图案或形状，从而大大降低了序列设计的复杂性。DNA折纸画布的高精度变换将有助于图形信息加密和存储策略的构建。
