Nat Commun丨二肽凝聚体作为人工无膜细胞器用于生物正交催化
大家好，今天给大家分享一篇2024年1月发表在Nature Communications上的文章“Dipeptide coacervates as artificial membraneless organelles for bioorthogonal catalysis”
通讯作者是来自马克斯·普朗克高分子研究所的Lucas Caire da Silva和Katharina Landfester教授。Silva教授的研究方向主要为从头开始设计和建造合成纳米和微反应器，模仿细胞的组织、适应性和结构特征； Landfester教授研究方向主要为构建生物医学应用的复杂纳米区室、刺激响应纳米胶囊和多区室聚合物纳米颗粒的开发和表征。
1.研究背景
构建具有生物特性的人工细胞使我们能够重现栩栩如生的细胞行为。基于液滴凝聚物的生命系统具有与细胞无膜细胞器（也称为生物分子凝聚物）相似的生理和功能特性，引起人们的广泛关注。尽管液滴凝聚物与生物分子凝聚物具有相似的形成机制和物理性质，但它们作为具有功能的人工细胞器还具有一定的局限性。大多数液滴凝聚物是由聚阴离子（例如 ATP、DNA 和羧甲基葡聚糖）和聚阳离子（例如聚-L-赖氨酸、二乙氨基乙基葡聚糖和聚精氨酸）通过电荷形成的，具有多组分性质,因此缺乏对尺寸和稳定性的控制。其次，高电荷密度和复杂的分子结构限制了它们在活细胞中的生物相容性和适用性。
近期，基于肽的凝聚物被认为是聚电解质凝聚物的替代品，并引起了仿生学界的极大兴趣。基于肽的凝聚物具有多个克服聚电解质凝聚物局限性的潜力：（1）肽具有生物学性质，这增加了肽基材料与生命系统的生物相容性；（2）基于肽的凝聚物的形成主要通过多价弱相互作用发生，包括π-π、阳离子-π和氢键，与活细胞中生物分子凝聚物相类似；（3）肽基凝聚物具有序列-结构-功能关系，即使是在单个氨基酸水平的改变，也直接决定了分子结构和材料性质。因此，肽基凝聚物具有作为人工细胞的极大潜力。
过渡金属催化剂是酶的重要互补催化物质，在有机合成、合成生物学和生物医学工程领域发挥着重要作用。由于其高效率和化学多功能性，可以引入细胞内进行生物正交催化，这被认为是细胞内生成活性物质的强大工具。然而，由于其有限的水溶性和低生物相容性，构建适宜过渡金属催化剂的反应器仍然困难。肽基凝聚物高度可定制的微环境为创建含有活性成分的人工细胞提供了机会。构建适合过渡金属催化剂的肽基人工细胞将是生物技术和合成生物学领域的一个重要里程碑。
2.研究结果
结果1 自缔合二肽凝聚物的分子设计和形成
本研究中，研究者以二苯丙氨酸为中心（缩写为FF），将FF肽C末端用甲氧基（OMe）进行取代，生成甲氧基-二苯丙氨酸（FF-OMe）。研究发现，FF-OMe发生相分离并受pH的影响（图1 a）。室温下完全溶于pH~6的HEPES缓冲液中，在pH~9下形成典型尺寸为1-10μm的球形液滴，液滴能够融合和变形，显示出液态特性（图1 b-e）。研究者将这种行为归因于氨基的去质子化以及由此产生的二肽在水溶液中的较低溶剂化。此外，在低pH值下，带正电的氨基之间的静电排斥似乎足以阻止二肽FF核心之间的π-π相互作用。在高pH值下，排斥力减弱，使二肽形成凝聚物。同时，pH的改变可实现二肽在溶液和液滴之间的循环相变（图1 f）。此外，相变对FF-OMe的浓度敏感，如，当FF-OMe浓度约为3 mg/mL时，在pH值为~7时观察到液滴形成。将FF-OMe浓度增加至20 mg/mL允许在较低pH值（6.5）下形成液滴（图1 g）。这种效应可归因于较高浓度的疏水性二肽产生更强的疏水效应。传统的聚电解质凝聚物通常由两个带相反电荷的组分组成，导致其较低的稳定性和有限的生物相容性。然而，基于肽的液滴是通过FF-OMe分子之间的自缔合进行同型相互作用的结果，这些分子对高电解质浓度具有抵抗力，例如高达1 M NaCl（图1 h）。
图1 二肽凝聚物的组成、形成和性质，以及凝聚物中酶催化反应
在证明二肽凝聚物可以通过液液相分离（LLPS）形成液体凝聚物后，研究者进一步探索其充当反应器的能力。他们使用罗丹明标记的辣根过氧化物酶（Rho-HRP）作为模型，发现二肽凝聚物具有捕获和浓缩客体生物大分子的能力（图1 i）。FF-OMe凝聚物中酶的高效封存和浓缩使它们能够作为酶微反应器。为了证明这一点，研究者将HRP封装在FF-OMe凝聚物中，然后进行Amplex Red底物和 H2O2处理。通过共聚焦成像和酶标仪监测反应过程，产物形成的线性动力学数据分析表明在凝聚物存在下，反应速率增加了约2倍（图 l I和m）。
结果2 二肽凝聚物可有效封装疏水性和芳香族分子
为了更深入地了解FF-OMe凝聚物的分配特性，研究人员探究了液滴内小分子的封存能力（图 2）。研究表明，具有芳香族部分和疏水特性显著的小分子荧光明显（1-7），表明肽凝聚物对其凝聚能力强，具有更大的亲和力。这些结果与二肽凝聚物的微环境比水更接近有机溶剂一致。
图2 FF-OMe凝聚物中客体分子的分布
结果3 用于水基体系中光催化的二肽微反应器
接下来，研究人员将二肽凝聚物作为微反应器，通过跟踪模型染料的光催化降解来研究疏水性光催化剂的性能。在这里，他们将DTB作为金属疏水催化剂，亚甲基蓝作为底物。光照条件下，DTB将氧气催化为ROS，亚甲基蓝被其氧化褪色(图 3 a)。首先，研究者发现DTB可被募集到二肽凝聚物中，而DTB在微反应器中的吸收峰在455 nm处出现轻微红移。这可能是由于通过液滴中DTB和苯丙氨酸之间的分子间芳香相互作用的增强导致的。同时，分散在PBS中的游离DTB几乎没有发射，但DTB微反应器的荧光发射强度要高出~80倍（图 3 b-c）。研究人员通过监测可见光照射下亚甲基蓝的降解探究DTB微反应器的光催化性能。研究表明，仅5分钟后，约95%的底物在pH~8下被DTB微反应器降解。相比之下，在没有凝聚物的情况下进行相同的反应，即使长时间照射，染料降解率也低于20%（图 3 d-e）。
图3 二肽凝聚体的光催化作用
结果4 基于二肽的微反应器可在水中实现过渡金属催化
接下来，研究者进一步研究了二肽凝聚物在金属基催化中的适用性。为此，研究人员将过渡金属催化剂[Cp*Ru（cod）Cl]（缩写为Ru）掺入FF-OMe凝聚物中，带有保护基的荧光染料在Ru的作用下脱去保护剂，发出荧光（图4 a与g）。在Ru微反应器中，观察到底物Rho的快速脱落，染料荧光强度相应增加（图4 b-f，图4 h-I）。有趣的是，两种染料表现出不同的变化趋势。对于Rho-pro，最初被Ru微反应器隔离，随着反应的进行，荧光强度在微反应器内逐渐增强，随后产物Rho（P=1.2）从微反应器释放到周围的水性介质中。对于Reso-pro，随着时间的增加，染料荧光强度增加，但产物Reso（P = 344）仍然保留在微反应器内（图4 d与j）。这可能由于产物Rho（P=1.2）与Reso（P = 344）对二肽凝聚物的亲和力不同。总之，二肽凝聚物实现了产物的浓缩与释放，这些属性可以在调节细胞内生物区室的通讯中发挥关键作用。
图4 二肽凝聚物的生物正交催化
结果5 二肽在人工细胞中作为合成细胞器
接下来，研究者试图使用二肽微反应器构建具有催化性能的人工细胞。为了创建人工细胞，作者结合了两种类型的凝聚物：基于聚电解质凝聚物和基于肽凝聚物。二肽凝聚物形成内部细胞器样结构，周围环绕着富含聚电解质的相。研究者通过带正电荷的季铵化直链淀粉（Q-Am）和带负电荷的羧甲基化直链淀粉（C-Am）制备聚电解质凝聚物。同时在聚电解质凝聚物的界面上包裹BSA@MnO纳米粒子对凝聚物进行稳定。共聚焦证实了人工细胞的多室结构，其中二肽凝聚物被封装在聚电解质的凝聚相中（图5 a-e）。不同凝聚物产生不同微环境，复合的凝聚物对亲水性分子（如FITC-BSA）具有更高的亲和力，而基于二肽的凝聚物对疏水性分子（如尼罗河红）具有更高的亲和力（图5 f）。随后，研究者构建了含有 Ru的人工细胞，将Rho-pro作为其底物。共聚焦显微镜显示人工细胞内的荧光强度逐渐增加，表明Rho的产生。相反，使用缺乏Ru细胞器的人工细胞未观察到荧光的生成（图5 h-k）。同时，在含有Ru的人工细胞中，亲水产物位于富含聚电解质的相内，表明反应产物是由Ru细胞器释放的（图5 l-m）。
图5 二肽凝聚物在人工细胞中作为合成细胞器
结果6 二肽凝聚物在活细胞中作为人工细胞器
在展示了基于二肽凝聚物在人工细胞中的应用后，研究者继续研究它们作为活细胞内催化细胞器的潜在用途（图6 a）。动态光散射DLS和共聚焦成像显示，二肽凝聚物的液滴直径约为1 μm，粒径分布相对较窄（图 6 b）。为了研究二肽凝聚物在活细胞的递送，用HeLa细胞进行了共定位实验。共聚焦成像表明，在与HeLa细胞孵育2小时后，在细胞内检测到装载尼罗河红的凝聚物的红色荧光，表明内化成功，溶酶体染色剂 Lysol-tracker green 发出的绿色信号显示出与其较小的共定位，表明其内化并未严格遵循传统的内吞途径（图6 e）。研究人员进一步评估Ru二肽凝聚物的细胞内催化活性。通过将Ru催化剂封装在FF-OMe凝聚物中来制备Ru细胞器，一旦进入细胞，Ru细胞器就显示出生物正交催化活性，在不存在Ru催化剂或将Ru催化剂直接添加到溶液中的对照实验中，观察到荧光强度明显降低。表明催化剂在细胞中的成功内化和活化需要二肽凝聚物提供合适的微环境（图6 f）。重要的是，通过 MTT 测定和活/死细胞成像证实Ru 细胞器处理 HeLa 细胞并未显著影响其活性（图6 c-d）。
图6 二肽凝聚物作生物细胞中的合成细胞器
3． 总结
总结来说，本研究工作构建了具有良好生物相容性，且分子结构简单的二肽凝聚物，使其成为生物技术中各种应用的理想材料。二肽凝聚物具有疏水微环境，是多功能的反应中心，增强了水溶液中的酶催化、光催化、过渡金属催化活性，实现了在水性介质中通常不可进行的化学反应。同时，二肽凝聚物可以组装为多区室人工细胞，创建复杂的催化系统。
原文链接：Cao, S., Ivanov, T., Heuer, J. et al. Dipeptide coacervates as artificial membraneless organelles for bioorthogonal catalysis. Nat Commun 15, 39 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-023-44278-9
