课题组工作丨Nucleic Acids Research丨RFC1 AAGGG五核苷酸重复序列结构研究揭示G-四链体导致CANVAS疾病中基因表达失调
超过50种人类神经退行性疾病是由特定基因中的短串联重复性序列扩增所导致，包括渐冻症、亨廷顿舞蹈症等[1, 2]。这类疾病的发生机制复杂，目前尚无可行的治疗方法。靶向重复序列核酸结构有望成为治疗这类疾病的新策略。CANVAS（cerebellar ataxia with neuropathy and vestibular areflexia syndrome）是小脑共济失调、神经病变和前庭无弹性综合征，由复制因子C亚基1（RFC1）基因2号内含子中AAGGG五核苷酸重复序列的扩增所导致[3-6]。正常的RFC1基因在Alu元件的polyA尾部含有良性的(AAAAG)n或(AAAGG)n重复序列，然而在CANVAS患者RFC1基因中出现频率最高的则是富含鸟嘌呤的(AAGGG)n重复扩增（n=400-2000）（图1A）。此外，越来越多的研究表明RFC1 AAGGG重复序列扩增与其他几种神经退行性疾病相关，包括帕金森病（PD）、多系统萎缩（MSA）和慢性特发性轴索性多神经病（CIAP）。因此，明确致病性RFC1 AAGGG重复序列的核酸结构和功能对于相关疾病的机理研究和药物研发具有十分重要的意义。
2024年1月24日，中国科学院杭州医学研究所/上海交通大学医学院分子医学研究院-韩达研究员/郭沛副研究员团队在Nucleic Acids Research上发表了题为“Structural investigation of pathogenic RFC1 AAGGG pentanucleotide repeats reveals a role of G-quadruplex in dysregulated gene expression in CANVAS”的研究。该工作报道了致病性RFC1 AAGGG重复序列能够在DNA和RNA分子层面形成平行G-四链体（G4）结构，并通过液体核磁共振技术测定了DNA双分子平行G4的高分辨率三维空间结构；利用结合并稳定G4结构的小分子配体，发现RFC1 AAGGG重复序列的G4结构阻碍DNA复制和下调基因表达。该研究首次揭示了RFC1 AAGGG重复序列在CANVAS等神经退行性疾病中的潜在致病分子途径，并提供重要结构基础以助开发靶向核酸的小分子药物/蛋白用于疾病治疗。
图1 （A）正常RFC1基因中的非致病性AAAAG重复序列和CANVAS患者中致病性AAGGG重复序列扩增；（B）d(AAGGG)2AA双分子平行G4的溶液核磁结构（PDB ID: 8X1V）。
在本工作中，我们首先利用液体核磁共振波谱和圆二色光谱研究AAGGG DNA重复序列的溶液结构，发现含有两个重复单元的d(AAGGG)2在150 mM K+条件下形成双分子（bimolecular）和四分子（tetramolecular）的平行G4结构。为进一步测定高分辨率三维空间结构，在3'末端添加两个腺嘌呤核苷酸，所得d(AAGGG)2AA形成单一的双分子G4结构。接下来，我们制备特定位点15N同位素标记DNA样品，采集多种二维核磁谱图（NOESY、DQF-COSY、TOCSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC和1H-15N HSQC）并从中提取大量结构约束参数，结合约束型分子动力学计算成功测定d(AAGGG)2AA的G4结构（图1B）。该G4结构包含三个G-四分体平面：G3a·G8a·G3b·G8b，G4a·G9a·G4b·G9b和G5a·G10a·G5b·G10b，每相邻两层之间形成较强的碱基堆积力。为了连接三个G-四分体平面，A6a/A6b和A7a/A7b的磷酸骨架链被扭曲以形成螺旋桨环。通过与Protein Data Bank中G4-小分子复合物结构进行比对，并结合荧光和圆二色光谱加以验证，发现小分子N-methyl mesoporphyrin IX（NMM）能够结合并稳定AAGGG重复序列的G4结构。同时，我们也证明更长的DNA和RNA AAGGG重复序列能够形成分子内平行G4结构，且NMM能够结合分子内平行G4结构。这些结果为我们进一步探索致病性RFC1 AAGGG重复序列可能介导的异常生理过程奠定了重要基础。
图2 （A）体外DNA引物延伸实验；（B）HEK293T活细胞基因表达实验。
重复序列扩增疾病中的DNA损伤程度普遍较高，这通常是由于扩增的重复序列在DNA复制过程中形成非B型DNA结构导致复制停滞。为探究致病性RFC1 AAGGG重复序列是否干扰DNA复制，我们利用DNA聚合酶I的Klenow片段（KF）进行了体外引物延伸实验（图2A）。结果显示当模板链上含有8个重复单元的(AAGGG)8序列时，全长的延伸产物随着反应体系中钾离子浓度的升高呈现出明显下降的趋势。此外，在20 mM低钾离子条件下，增加小分子NMM浓度也能显著降低全长延伸产物。这些结果表明，AAGGG重复序列所形成的G4结构对DNA复制过程有阻碍作用。对照组显示正常RFC1基因中的非致病AAAAG重复序列对DNA复制进程无影响。此外，近期研究发现CANVAS患者的RFC1蛋白水平降低并伴随蛋白质功能丧失，但其基因表达降低的潜在分子机制尚不清楚[7, 8]。因此，我们进一步探索AAGGG重复序列中G4结构的形成是否会影响基因表达（图2B）。基于pBudCE4.1载体构建了用以活细胞内表达报告基因的质粒，该质粒在CMV启动子下表达EGFP蛋白，并将具有不同重复长度（n=8，30）的致病性AAGGG重复序列或非致病性AAAAG重复序列插入EGFP编码序列的上游。共聚焦显微镜和细胞流式结果表明，转染AAGGG重复序列的细胞中EGFP蛋白水平显著降低，并利用具有稳定G4作用的NMM处理细胞来进一步验证蛋白水平的降低确实是由AAGGG重复序列中的G4形成所引起的。这些结果表明，AAGGG重复序列中G4结构的形成会减少基因表达，并且较长的重复序列具有更显著的抑制作用。此外，通过RT-qPCR检测发现EGFP mRNA的转录不受AAGGG重复序列的影响，因此可认为蛋白表达水平的下降是由AAGGG RNA G4结构介导的翻译异常所引起。
图3 致病性RFC1 AAGGG重复序列中G4结构的形成对DNA复制和基因表达的影响。
自发现RFC1 AAGGG重复序列扩增与CANVAS和其他几种神经退行性疾病的相关性以来，近五年尚无关于AAGGG重复序列如何发挥不利生理功能的分子机制报道。本研究验证了RFC1 AAGGG重复序列可以形成DNA和RNA平行G4结构，其寡聚状态取决于重复数目和侧翼残基。同时，本研究首次提供了AAGGG DNA重复序列G4的高分辨率液体核磁共振结构，这些信息将有助于合理设计能够解开G4结构的解旋酶和小分子药物，也为CANVAS和其他相关神经退行性疾病中的基因表达失调和细胞功能障碍的机制研究提供重要基础。
参考文献
1. Malik, I., C.P. Kelley, E.T. Wang, et al., Molecular mechanisms underlying nucleotide repeat expansion disorders. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2021. 22(9): p. 589-607.
2. Varshney, D., J. Spiegel, K. Zyner, et al., The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2020. 21(8): p. 459-474.
3. Cortese, A., S. Tozza, W.Y. Yau, et al., Cerebellar ataxia, neuropathy, vestibular areflexia syndrome due to RFC1 repeat expansion. Brain, 2020. 143(2): p. 480-490.
4. Tranchant, C. and M. Anheim, CANVAS: a very late onset cerebellar ataxia, due to biallelic expansions in the RFC1 gene. Rev. Neurol. (Paris), 2019. 175(9): p. 493-494.
5. Cortese, A., R. Simone, R. Sullivan, et al., Biallelic expansion of an intronic repeat in RFC1 is a common cause of late-onset ataxia. Nat. Genet., 2019. 51(4): p. 649-658.
6. Dominik, N., V. Galassi Deforie, A. Cortese, et al., CANVAS: a late onset ataxia due to biallelic intronic AAGGG expansions. J. Neurol., 2021. 268(3): p. 1119-1126.
7. Ronco, R., C. Perini, R. Curro, et al., Truncating variants in RFC1 in Cerebellar Ataxia, Neuropathy, and Vestibular Areflexia Syndrome. Neurology, 2023. 100(5): p. e543-e554.
8. Benkirane, M., D. Da Cunha, C. Marelli, et al., RFC1 nonsense and frameshift variants cause CANVAS: clues for an unsolved pathophysiology. Brain, 2022. 145(11): p. 3770-3775.
原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae032
共同第一作者：王杨（2023级博士生），汪俊彦助理研究员
通讯作者：韩达研究员，郭沛副研究员
