Adv Sci | 复制解旋酶和SSB的共同作用保证G-四链体固有的复制耐受性
大家好，今天分享一篇2023年12月发表在Adv. Sci. 上的文章，题目为Joint Efforts of Replicative Helicase and SSB Ensure Inherent Replicative Tolerance of G-Quadruple.
作者介绍
本文的通讯作者是上海科技大学生命科学与技术学院的孙博研究员，研究方向为单分子酶学及生物物理学。利用光镊、荧光共振能量转移等单分子技术围绕DNA复制、修复、编辑等代谢过程进行重要分子机器的动力学解析。
背景介绍
在DNA复制过程中，复制体不可避免地会遇到各种障碍，如DNA损伤、DNA结合蛋白(SSB)、DNA二级结构等，导致复制叉停止和崩溃，引起基因组不稳定和染色体畸变。目前的克服途径可以大致分为两类：
1.复制复合体可以通过拆除或忍受障碍直接通过受干扰的DNA合成。这些途径通常在核心复制体之外部署额外的蛋白质，如解旋酶、核酸酶和翻译聚合酶，以处理这些障碍。
2.复制体可以找到一种绕过障碍的方法，在不处理它的情况下继续复制。
G4结构是阻碍复制体顺利进行的主要因素之一，G4的复制耐受性复制体可以利用G4解旋酶和SSB解开G4，如FANCJ和CST，在DNA聚合前将G4转化为ssDNA。或者使用特殊的蛋白质，如PrimPol或BRAC1/2，绕过G4而不阻碍复制叉。尽管已经进行了广泛的研究，仍有许多问题待解决。例如，个体复制蛋白和复制体复合物耐受G4的内在能力是什么? G4的稳定性和位置如何调节一个复制体的耐受策略?
噬菌体T7复制体模型介绍
为了解决上述问题，作者利用噬菌体T7复制体作为模型复制系统。在T7噬菌体内，初级DNA复制只需要四种蛋白质:T7解旋酶-引物酶(gp4，以下简称T7解旋酶)解绕DNA并引物DNA合成;基因5蛋白(gp5)与加工因子大肠杆菌硫氧还蛋白(trx)络合负责DNA聚合(以下简称gp5和trx复合物T7 DNAP);基因2.5的产物(gp2.5)是一种单链DNA结合蛋白，可以阻止DNA二级结构的形成。
T7 DNAP对前导链G4反应的冲突结果
鉴于G4的稳定性与环长呈负相关，作者设计了两种G4模板：sG4(强G4)和wG4(弱G4)模板(图1A)，引物延伸实验结果表明：虽然sG4是一个实质性的障碍，但T7 DNAP单独可以通过破坏sG4结构完成DNA合成(图1B-C)。作者假设是G4不稳定力帮助T7 DNAP克服G4，采用基于光镊技术的链置换DNA合成分析来验证这一假设(图1D-F)。发现T7 DNAP在引物延伸实验和链位移DNA合成实验中对wG4lead表现出冲突的结果：链位移DNA合成实验中，T7 DNAP也被wG4lead (表示位于前导链上的wG4)阻碍了大部分。
图1 分子内G4结构对T7 DNAP合成的影响
无催化活性的T7 DNAP结合G4诱导叉阻碍DNA合成
为了解释前面相冲突的结果，又设计wG4lag（表示位于滞后链上的wG4）模板(图2A)，前导链T7 DNAP不会受到这些滞后链G4的阻碍，除非现有的G4诱导叉有助于阻碍。结果发现前导链或滞后链G4所形成的“泡状”叉结会导致无活性T7 DNAP的结合,除G4外，这些无活性的DNAP对DNA的合成构成强烈阻碍(图2)。
图2 T7 DNAP与G4诱导的叉结结合从而阻碍DNA合成
T7解旋酶可以分解G4结构并拆除非活性T7 DNAP
有研究表明复制解旋酶除了在DNA复制过程中催化链分离，还具有障碍拆除和DNAP协调的功能，作者猜测T7解旋酶也能拆除在复制过程中由G4和非活性的T7 DNAP所形成的阻碍。由于T7解旋酶在复制过程中主要沿着DNA的后链进行跟踪，作者首先构建了位于后链上的G4的叉形DNA模板(G4lag)，结果表明T7解旋酶可以解开sG4lag和wG4lag（图3A-C）。随后作者探究了当与G4诱导叉结合的非活性T7 DNAP存在时，T7 解旋酶也能解除非活性的T7 DNAP形成的障碍，并解开G4从而使复制正常进行（图3D-G）。
图3 T7解旋酶解除DNAP并解开G4
T7解旋酶通过G4lag和wG4lead辅助T7 DNAP的合成
考虑到T7解旋酶能够分解非活性DNAP并解开G4，作者接下来想知道它是否能帮助T7 DNAP耐受G4。结果表明对于前导链上的G4，不管是sG4还是wG4, T7解螺旋酶偶联的T7 DNAP都能克服障碍，显示出DNA复制活性。然而，对于前导链上的强G4所形成的障碍，T7解旋酶偶联的T7 DNAP是无法逾越的(图4)。
图4 T7解旋酶偶联T7 DNAP使含G4的DNA复制
Gp2.5和T7解旋酶维持sG4处于未折叠状态
gp2.5作为一种ssDNA结合蛋白，通过与T7 DNAP和T7解旋酶的物理相互作用来保护ssDNA并协调复制进程。通过smFRET实验，作者发现gp2.5单独无法展开sG4，而T7解旋酶只能展开sG4是不稳定的，短暂的解开后sG4会再折叠。当T7解旋酶短暂解绕sG4后，gp2.5可与未折叠的sG4基序结合，使其保持未折叠状态(图5）。
图5 T7解旋酶和gp2.5对sG4的调节作用
T7解旋酶和SSB辅助T7 DNAP克服sG4lead完成复制
作者通过引物延伸实验来检验gp2.5的在复制体系中的特异性贡献，结果表明只有在T7解旋酶和gp2.5的共同辅助下，T7 DNAP克服sG4lead完成复制(图6)。
图6 T7 DNAP在T7解旋酶和SSB蛋白存在下可以克服含sG4lead继续复制
总结
1.本文深入研究了T7复制体内的个体复制蛋白如何响应预先形成的分子内G4。当互补DNA链缺失时，DNAP本身具有通过弱G4进行破坏和合成的内在能力。
2.提出两种新途径(图7)，都不需要特殊的DNA解旋酶或聚合酶，表明T7复制体天生就允许G4复制。
3.G4位置和稳定性在调节G4克服通路选择中具有重要作用。
图7 T7复制体克服分子内G4s的两种模型
