韩 达 课 题 组

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Adv Sci | 复制解旋酶和SSB的共同作用保证G-四链体固有的复制耐受性

 

大家好,今天分享一篇202312月发表在Adv. Sci. 上的文章,题目为Joint Efforts of Replicative Helicase and SSB Ensure Inherent Replicative Tolerance of G-Quadruple.

作者介绍

本文的通讯作者是上海科技大学生命科学与技术学院的孙博研究员,研究方向为单分子酶学及生物物理学。利用光镊、荧光共振能量转移等单分子技术围绕DNA复制、修复、编辑等代谢过程进行重要分子机器的动力学解析。

背景介绍

DNA复制过程中,复制体不可避免地会遇到各种障碍,如DNA损伤、DNA结合蛋白(SSB)DNA二级结构等,导致复制叉停止和崩溃,引起基因组不稳定和染色体畸变。目前的克服途径可以大致分为两类:

1.复制复合体可以通过拆除或忍受障碍直接通过受干扰的DNA合成。这些途径通常在核心复制体之外部署额外的蛋白质,如解旋酶、核酸酶和翻译聚合酶,以处理这些障碍。

2.复制体可以找到一种绕过障碍的方法,在不处理它的情况下继续复制。

G4结构是阻碍复制体顺利进行的主要因素之一,G4的复制耐受性复制体可以利用G4解旋酶和SSB解开G4,如FANCJCST,在DNA聚合前将G4转化为ssDNA。或者使用特殊的蛋白质,如PrimPolBRAC1/2,绕过G4而不阻碍复制叉。尽管已经进行了广泛的研究,仍有许多问题待解决。例如,个体复制蛋白和复制体复合物耐受G4的内在能力是什么? G4的稳定性和位置如何调节一个复制体的耐受策略?

 

噬菌体T7复制体模型介绍

为了解决上述问题,作者利用噬菌体T7复制体作为模型复制系统。在T7噬菌体内,初级DNA复制只需要四种蛋白质:T7解旋酶-引物酶(gp4,以下简称T7解旋酶)解绕DNA并引物DNA合成;基因5蛋白(gp5)与加工因子大肠杆菌硫氧还蛋白(trx)络合负责DNA聚合(以下简称gp5trx复合物T7 DNAP);基因2.5的产物(gp2.5)是一种单链DNA结合蛋白,可以阻止DNA二级结构的形成。

 

T7 DNAP对前导链G4反应的冲突结果

鉴于G4的稳定性与环长呈负相关,作者设计了两种G4模板:sG4(G4)wG4(G4)模板(1A),引物延伸实验结果表明:虽然sG4是一个实质性的障碍,但T7 DNAP单独可以通过破坏sG4结构完成DNA合成(1B-C)。作者假设是G4不稳定力帮助T7 DNAP克服G4,采用基于光镊技术的链置换DNA合成分析来验证这一假设(1D-F)。发现T7 DNAP在引物延伸实验和链位移DNA合成实验中对wG4lead表现出冲突的结果:链位移DNA合成实验中,T7 DNAP也被wG4lead (表示位于前导链上的wG4)阻碍了大部分。

1 分子内G4结构对T7 DNAP合成的影响

 

无催化活性的T7 DNAP结合G4诱导叉阻碍DNA合成

为了解释前面相冲突的结果,又设计wG4lag(表示位于滞后链上的wG4)模板(2A),前导链T7 DNAP不会受到这些滞后链G4的阻碍,除非现有的G4诱导叉有助于阻碍。结果发现前导链或滞后链G4所形成的“泡状”叉结会导致无活性T7 DNAP的结合,G4外,这些无活性的DNAPDNA的合成构成强烈阻碍(2)

2 T7 DNAPG4诱导的叉结结合从而阻碍DNA合成

 

T7解旋酶可以分解G4结构并拆除非活性T7 DNAP

有研究表明复制解旋酶除了在DNA复制过程中催化链分离,还具有障碍拆除和DNAP协调的功能,作者猜测T7解旋酶也能拆除在复制过程中由G4和非活性的T7 DNAP所形成的阻碍。由于T7解旋酶在复制过程中主要沿着DNA的后链进行跟踪,作者首先构建了位于后链上的G4的叉形DNA模板(G4lag),结果表明T7解旋酶可以解开sG4lagwG4lag(图3A-C)。随后作者探究了当与G4诱导叉结合的非活性T7 DNAP存在时,T7 解旋酶也能解除非活性的T7 DNAP形成的障碍,并解开G4从而使复制正常进行(图3D-G)。

3 T7解旋酶解除DNAP并解开G4

 

T7解旋酶通过G4lagwG4lead辅助T7 DNAP的合成

考虑到T7解旋酶能够分解非活性DNAP并解开G4,作者接下来想知道它是否能帮助T7 DNAP耐受G4。结果表明对于前导链上的G4,不管是sG4还是wG4, T7解螺旋酶偶联的T7 DNAP都能克服障碍,显示出DNA复制活性。然而,对于前导链上的强G4所形成的障碍,T7解旋酶偶联的T7 DNAP是无法逾越的(4)

T7解旋酶偶联T7 DNAP使含G4DNA复制

 

Gp2.5T7解旋酶维持sG4处于未折叠状态

gp2.5作为一种ssDNA结合蛋白,通过与T7 DNAPT7解旋酶的物理相互作用来保护ssDNA并协调复制进程。通过smFRET实验,作者发现gp2.5单独无法展开sG4,而T7解旋酶只能展开sG4是不稳定的,短暂的解开后sG4会再折叠。当T7解旋酶短暂解绕sG4后,gp2.5可与未折叠的sG4基序结合,使其保持未折叠状态(5)。                                           

T7解旋酶和gp2.5sG4的调节作用

 

T7解旋酶和SSB辅助T7 DNAP克服sG4lead完成复制

作者通过引物延伸实验来检验gp2.5的在复制体系中的特异性贡献,结果表明只有在T7解旋酶和gp2.5的共同辅助下,T7 DNAP克服sG4lead完成复制(6)

T7 DNAPT7解旋酶和SSB蛋白存在下可以克服含sG4lead继续复制

 

总结

1.本文深入研究了T7复制体内的个体复制蛋白如何响应预先形成的分子内G4。当互补DNA链缺失时,DNAP本身具有通过弱G4进行破坏和合成的内在能力。

2.提出两种新途径(7),都不需要特殊的DNA解旋酶或聚合酶,表明T7复制体天生就允许G4复制。

3.G4位置和稳定性在调节G4克服通路选择中具有重要作用。

 

T7复制体克服分子内G4s的两种模型

 

2024年1月23日 15:18
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