JACS丨RNA肿瘤治疗：细胞内发夹RNA组装实现MicroRNA触发的抗癌功能
大家好，我要分享的文献是2023年12月发表在《美国化学学会杂志》上的一篇名为“RNA Oncological Therapeutics: Intracellular Hairpin RNA Assembly Enables MicroRNA-Triggered Anticancer Functionality”的论文。这篇论文的通讯作者是东京大学材料工学系的岡本晃充教授。该研究设计并合成了一种RNA发夹对（oHP），它对表达丰富的致癌microRNA-21（miR-21）的癌细胞具有选择性细胞毒性。这项工作首次使用短RNA分子作为由致癌miRNA触发的积聚型抗癌剂。
背景
传统的药物发现依赖于小分子来定位蛋白质并抑制其功能，但只有很少一部分蛋白质（约10-14%）具有活性结合位点，这些位点被认为是小分子药物的治疗靶点。在这种情况下，RNA疗法，包括短干扰RNA（siRNA）、microRNA（miRNA）模拟物、用于CRISPR/Cas9系统的单向导RNA和mRNA药物，被认为是一个吸引人的研究领域，因为它们有望解决当前医疗需求。尽管抗癌RNA药物得到了广泛的研究，但目前还没有基于RNA分子的抗癌药物获得批准。这可能是因为传统的RNA药物靶向mRNA，而基因靶点的选择仍然是一个重大挑战，特别是对于体内应用。因此，有必要开发一种与传统RNA疗法完全不同的新模式。
将外源RNA引入细胞会引发免疫反应，被机体视为入侵者，类似于病毒。因此，外源RNA被认为是有潜力的抗癌剂，可以引起免疫细胞毒性。聚肌苷-聚胞苷酸（poly(I:C)）是长双链RNA（dsRNA）的合成类似物，是癌症免疫治疗的候选材料。Poly(I:C)具有与病毒感染相关的分子模式，并能被各种RNA传感器识别，例如Toll样受体3、视黄酸诱导蛋白I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关基因5（MDA-5），从而导致I型干扰素（INF）（例如INF-β）的产生。尽管poly(I:C)的免疫原性可以有效缩小肿瘤，但由于缺乏癌症选择性，全身免疫毒性是其临床应用的缺点。
原位扩增RNA序列是克服外源长dsRNA细胞毒性挑战的理想方法。杂交链式反应（HCR）是一种等温核酸组装技术，由Dirks和Pierce开发，是一种触发扩增方法，这种无酶反应利用起始链和两个核酸发夹。在没有起始链的情况下，发夹不相互作用，以确保起始链能够选择性触发以产生长的切口核酸双链体。HCR已成功应用于各种领域，包括分子成像、药物递送、免疫信号检测、小分子释放、正交DNA组装和癌症转移抑制等，其检出限范围从nM到aM，并允许在细胞和动物中应用。。
图1.通过miR-21触发的发夹RNA组装实现选择性抗癌功能。
最近，该研究小组利用microRNA-21（miR-21）触发的细胞内DNA-HCR，成功实现了对癌细胞的选择性细胞毒性诱导。他们设计的DNA发夹对在miR-21表达丰富的细胞中自组装成长的切口DNA双链体，通过环GMP-AMP合酶（cGAS）的识别，激活了干扰素基因（STING）通路的接头蛋白刺激因子。miR-21是一种典型的致癌miRNA（oncomiR），能够诱导癌细胞中选择性的干扰素-β（INF-β）产生和细胞毒性。然而，免疫细胞毒性不仅取决于miR-21的水平，还取决于cGAS-STING的表达水平。因此，该研究报道了一种新的策略，基于使用RNA发夹对作为细胞毒性放大器，来扩展细胞内HCR在癌症治疗中的效果。设计的RNA发夹对（oHPs）能够组装成由miR-21触发的长的切口双链RNA，从而对特定的癌症生物标志物产生治疗反应。由此产生的长双链RNA模拟物将被各种双链RNA结合蛋白识别，包括RIG-I和MDA-5，为不同类型的癌症提供治疗效果。
miRNA是一种小的单链非编码RNA分子，通过与互补的mRNA的3′非翻译区结合来调节基因表达。据估计，人类中超过60%的蛋白质编码基因含有miRNA靶位点，miRNA的失调与各种人类疾病的发展有关。先前的研究表明，在几种癌细胞系中miR-21都被过度表达，例如乳腺癌MDA-MB-231、宫颈癌HeLa和肺癌A549细胞，其水平比在正常胚胎肺细胞系MRC-5中观察到的水平高出数十到数千倍。该研究证明了设计的发夹RNA对在富含miR-21的细胞系中表现出选择性细胞毒性。通过观察小鼠肿瘤的生长抑制，进一步强调了该策略的治疗潜力。这种方法基于RNA结构与其识别分子之间的相互作用，实现了癌症的RNA治疗。
结果
- RNA发夹对的设计与优化
相对于DNA-HCR，有关RNA-HCR的研究报道较少。因此，本研究设计了新的RNA发夹对，使用NUPACK软件评估了对miR-21的HCR响应。NUPACK是一种在线软件，用于预测核酸结构的热稳定性。oHP-1具有一个突出的5'末端，能够与miR-21序列结合，以及一个能够与oHP-2结合的序列。oHP-2能够以半移位方式促进链杂交。为了优化动力学特性，研究设计了带有6-8个核苷酸脚趾区域的oHPs，并采用了硫代磷酸化以防止核酸酶降解（图2A）。通过天然琼脂糖凝胶电泳的结果发现，含有7个核苷酸的脚趾区域oHP对miR-21触发的RNA组装产生了最高的效率和选择性（图2B）。较短的脚趾区域（6个核苷酸）的oHP反应产物减少，而带有8个核苷酸脚趾区域的oHP出现了明显的背景反应。基于这一初步筛选，本研究选择了具有7个核苷酸脚趾区域的oHP进行后续实验。当序列长度在500至3000个碱基对之间时，就足以触发先天免疫激活。同样，miR-21的量会影响反应效率和产物大小。换句话说，较高的miR-21浓度
提高了组装效率并导致更短的产物。
图2.发夹RNA对的设计与优化。
随后，我们使用其他miRNA与oHP(7)进行反应，以进行特异性的评估，例如pre-miR-21、miR-7851和miR-122。结果显示，oHP(7)与其他miRNA的非特异性反应极小。Pre-miR-21是一种包含72个核苷酸的RNA，包含成熟的miR-21序列。miR-7851是一种人类miRNA，其序列与miR-21高度相似。miR-122是人体肝脏中丰富的miRNA，易受核酸硫代磷酸化等修饰影响而积聚。所有三个RNA序列几乎没有触发oHP(7)-1和oHP(7)-2的HCR，这表明oHP(7)在人体细胞和体内的脱靶效应微不足道，强调了该RNA发夹对治疗的高度针对性。只有具有一次错配的miR-21（miR-21（1MM））会诱导HCR，但由于miR-21（1MM）在细胞中不存在，因此它不会增加oHP(7)在人体细胞和体内的脱靶效应。
另外，为了评估活细胞中的HCR效率，我们应用了分子信标系统（图3A），用FAM和BHQ-1（oHP(7)-2-MB）标记oHP(7)-2，并与oHP(7)-1及不同量的miR-21混合。通过记录在488nm处激发的溶液的荧光光谱来跟踪荧光强度（图3B）。随着miR-21添加量的增加，荧光逐渐升高，表明miR-21触发了RNA组装。
图3.miR-21触发的发夹RNA组装在人类活细胞中。
使用荧光激活细胞分选（FACS）分析转染oHP(7)-1和oHP(7)-2-MB的细胞（图3C）。测试了HEK293T细胞（一种缺乏miR-21的人类细胞系）以及HeLa和A549细胞（富含miR-21的人类癌细胞系），同时将与miR-21的反应可忽略不计的干扰RNA发夹对（scHP）作为对照。与scHP相比，转染oHP(7)后的荧光强度上升，而缺乏miR-21的HEK-293T细胞则没有荧光增强现象。HeLa和A549细胞表现出高于HEK-293T细胞的相对平均荧光强度表明该RNA发夹系统在人类活细胞中具有较好的miR-21识别能力（图3D）。
- 细胞内miR-21依赖性细胞毒性
我们将不同量的oHP(7)-1和oHP(7)-2转染到A549、HeLa、MDA-MB-231和MRC-5细胞中，然后进行细胞活力测定（图4）。同时，我们还测试了scHP作为对照。结果显示，仅在oHP(7)处理下，癌症A549、HeLa和MDA-MB-231细胞的活力随miR-21浓度增加而降低，而scHP和oHP(7)在正常MRC-5细胞中引起的细胞毒性可以忽略不计。这里使用的miR-21在人细胞中的表达水平按以下顺序排列：A549 > HeLa > MDA-MB-231 > MRC-5，表明oHP(7)可以区分细胞内miR-21浓度，从而选择性产生细胞毒性。值得注意的是，基于RNA的oHP对STING缺陷的A549细胞有效，而基于DNA的oHP在之前的结果中几乎没有表现出细胞毒性。与其他癌细胞系相比，Poly(I:C)在MRC-5细胞中显示出相似的细胞毒性，进一步支持oHP(7)的安全性。Patel和Kern报告称，由突变的mRNA触发的RNA-HCR介导细胞死亡没有选择性，这可能是因为非特异性聚集导致的。而我们的研究结果表明，与突变的mRNA相比，miRNA是一种很有前途的癌症生物标志物，可以通过RNA-HCR实现选择性细胞毒性。
图4.oHP(7)的miR-21依赖性细胞毒性。
为了进一步评估oHP(7)的抗癌功能，本研究使用伤口划痕试验研究了MDA-MB-231细胞的迁移能力。在对照或scHP处理的板中出现伤口面积减小，而在oHP(7)或poly(I:C)处理后细胞的板中保留了较大的间隙。与用scHP处理的细胞相比，oHP(7)处理的细胞表现出明显的伤口闭合延迟。这些结果表明，oHP(7)会降低细胞活力和迁移能力，从而使其成为肿瘤转移的有效抑制剂。
- 细胞毒性机制
研究发现，细胞内DNA-HCR通过cGAS-STING通路介导先天性免疫反应来诱导细胞毒性。长RNA双链体也被几种细胞内RNA免疫传感器识别，包括MDA-5。由于INF-β是由先天免疫激活触发的主要细胞因子，因此本研究量化了INF-β的表达水平。通过mRNA定量结果显示，poly(I:C)在HeLa细胞中诱导了高INF-β mRNA表达，而oHP(7)几乎没有触发INF-β mRNA诱导表达，这与最初的假设相反。酶联免疫测定（ELISA）结果还表明，与poly(I:C)相比，oHP(7)分泌的INF-β量较低。
为了解决为什么oHP(7)不会诱导强烈的INF-β表达，本研究使用不同量的miR-21制备了短HCR产物和长HCR产物。将短HCR产物转染到HeLa细胞中后，细胞几乎没有激活INF-β表达，而长HCR产物诱导INF-β的水平与poly(I:C)相当，这表明来自miR-21和oHP(7)的细胞内HCR产物的长度不足以刺激细胞内RNA免疫传感器。这些观察结果促使本研究去研究oHP(7)细胞毒性的潜在机制，而不是如何刺激INF-β的表达。
细胞活力测定表明，尽管A549细胞据称表达更多的miR-21，但oHP(7)在HeLa细胞中诱导的细胞毒性高于A549细胞。这可能是由于在与miR-21结合中oHP(7)-1的消耗量更高导致A549细胞产生的HCR产物比HeLa细胞短。另一方面，与HeLa细胞和MDA-MB-231细胞相比，oHP(7)在MDA-MB-231细胞中诱导的晚期细胞凋亡率较低。划痕创面测定还显示，在MDA-MB-231细胞中oHP(7)表现出细胞毒性是通过抑制细胞增殖而不是诱导细胞死亡。
为了了解这种抑制细胞增殖的机制，本研究使用MDA-MB-231细胞进行了RNA测序（RNA-seq）分析。与未处理的细胞相比，oHP(7)转染细胞中有超过4000个mRNA的表达水平升高了2倍以上。使用Metascape对前3000个过表达的mRNA进行分类。在排名前20种中，有10种富集的本体与免疫或炎症有关，表明这与炎症效应相关。接着本研究使用GSEA软件将RNA-seq结果与已经针对miR-21验证的基因表达通路的可用数据集进行了比较。结果显示，前20个被oHP(7)改变表达的基因与118个被推定为miR-21靶标的基因之间没有重叠。因此，得出结论，图5A所示的20个基因的表达水平改变与miR-21没有直接关系；相反，这是由于oHP(7)在细胞中形成HCR。
为了进一步研究oHP(7)细胞毒性的潜在机制，本研究还进行了膜联蛋白V-碘化丙啶（PI）染色实验，结果表明oHP(7)处理的细胞的晚期凋亡比率远低于poly(I:C)处理的细胞。假设细胞周期停滞是由oHP(7)触发的，用PI染色oHP(7)处理的细胞，并使用FACS测量它们的细胞周期发现S期细胞群增加，G2/M期细胞受oHP(7)影响减少，表明细胞周期停滞在S期是oHP(7)细胞毒性的可能机制。
CDK1和CDK2是与细胞周期进程相关的细胞周期蛋白依赖性Ser/Thr蛋白激酶。细胞周期蛋白A2通过在从G2到M期过渡期间与CDK1相互作用来调节细胞周期进程，并在S期与CDK2相互作用。p21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，可作为细胞在G1和S周期进程的调节因子。定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析显示，oHP(7)处理后CDK1、CDK2和细胞周期蛋白A2的表达水平与scHP处理后检测到的水平相似，而p21表达显著升高，说明p21抑制了CDK2的反应并使活细胞在S期停滞。随后进一步分析了p53 mRNA的表达水平，p53 mRNA编码一种促进p21表达的转录因子，并且通常在各种类型的肿瘤中失活。p53 mRNA的表达仅在转染oHP(7)后才升高，这表明p53–p21信号转导是细胞内RNA-HCR细胞毒性的潜在机制。
图5.oHP(7)细胞毒性的机制分析。
- 小鼠的抗癌功能
在体内实验证实RNA发夹具有抗癌活性。研究使用携带高miR-21表达的C57BL/6NJcl小鼠的黑色素瘤B16细胞进行。实验中，研究人员在第0、3和6天局部施用了oHP(7)-1和oHP(7)-2的组合，使用两亲性多链体作为RNA递送载体。这种多链体已在体内转录mRNA的小鼠中证明了其出色的递送功能和安全性。研究人员使用琼脂糖凝胶电泳确认了每个RNA发夹和多链体的复合物形成。复合物由10 μg oHP(7)和90 μg多链体组成，通过瘤周注射给药3次，并记录治疗期间肿瘤生长和体重的变化。结果显示，与蔗糖和scHP（一种加扰序列对照RNA发夹对）相比，oHP(7)有效抑制了肿瘤生长，表明oHP(7)识别肿瘤中的miR-21并在该区域内产生RNA-HCR产物。然而，oHP(7)的抗肿瘤作用并不十分显著，因此有必要探索更合适的序列设计和药物递送系统，以实现更高效的体内应用。oHP(7)治疗组的体重变化与蔗糖对照组的体重变化相似，表明oHP(7)注射对小鼠的毒性较小。总的来说，这些体内实验结果强调了该RNA发夹组装系统作为一种有前途的抗癌策略，特别是针对oncomiR丰富的肿瘤细胞内环境。
图6.oHP(7)作为小鼠抗癌剂的评估。
结论
本文介绍了一种基于RNA的抗癌药物，它通过触发长链RNA双链体在细胞内的构建来发挥治疗作用。设计的RNA发夹对能够有选择性地对富含miR-21的癌细胞施加细胞毒性，同时保留对缺乏miR-21的正常细胞的影响。同时，研究还证明了RNA发夹对的细胞毒性依赖于p53-p21信号通路，该通路在细胞周期调节中起着至关重要的作用。体内研究结果显示，RNA发夹对能够有效抑制小鼠肿瘤的生长，凸显了其作为抗癌药物的潜力。
