NAT NANOTECHNOL丨多组分、进化的DNA纳米结构的等温自组装
大家好，今天给大家分享今年七月在Nature Nanotechnology上刊登的一篇文献，题名“Isothermal self-assembly of multicomponent and evolutive DNA nanostructures”。
一、作者简介
本文的通讯作者是来自法国索邦大学的Damien Baigl，他的实验室主要研究方向包括DNA纳米技术和合成生物学、光驱动微流体、咖啡环效应应用于低成本诊断等。
二、研究背景
自组装是指在没有人为干预的情况下，结构单元自发形成有序结构。从自然界中细胞的演变以及基于细胞的组织生长到人工合成纳米结构、自愈网结构等都是自组装过程。由于DNA利用碱基配对原理自发形成所需形状、大小和具有位置特异性功能的精细结构，DNA纳米技术在分子自组装方面展现出巨大潜力。目前DNA结构的组装通常需要热处理变性和退火的过程，这种热处理阻碍了DNA在固定的环境条件下自发形成纳米结构，并且使其较难和温度敏感的物质结合实现功能化，如蛋白质。
热退火产生的结构需要外界环境的驱动，本质上不是进化的。就此作者提出了问题：这种复杂的、多组分的DNA纳米结构能否在恒温下完美地自组装？目前已经存在一些等温系统，但均具有局限性，例如需要变性剂、特定DNA结构、较高工作温度等。
在本篇文献中，作者设计了一个DNA自组装系统，可以在室温或体温下自发形成广泛的精细纳米结构，且具备自发的可重构性。
图1 研究过程示意图
三、研究结果
- NaCl溶液中DNA纳米结构的自组装
1.1 自组装系统建立
作者认为在常温下的常规缓冲液TAM（Trizma-base 40 mM，Acetate 20 mM, MgCl2 12.5 mM）中无法形成自组装结构是由于镁离子稳定的碱基配对需要更高的热能来实现重构。因此，作者选择了一种替代缓冲液，称为TANa，它仅由Tris-acetate缓冲液组成，不含EDTA或镁/钙，并补充了NaCl以确保在阴离子DNA链之间有足够的静电屏蔽。作者通过原位实时原子力显微镜（AFM）观察到，当[NaCl] = 100 mM时，在25°C下几小时内加入的DNA链逐渐形成三角形折纸结构（图2）。
图2 TANa缓冲液中DNA的自组装流程示意及AFM结果
图3 加EDTA的TAMg、TAMg与TANa中DNA自组装情况对比
1.2 改变条件验证组装效率
作者在不同温度和NaCl浓度下重复实验，对自组装24小时后的折叠进行了表征。发现仅在中等浓度NaCl（50-250 mM），在15°C和60°C之间的不同温度下，可以获得部分折叠或完全折叠的折纸（图4）。因此，需要一定的静电屏蔽力来形成碱基配对，但不应太高，以保持一些短距离静电排斥并防止错配发生。
[NaCl] = 100 mM、温度25-40°C或[NaCl] = 150 mM、温度15-55°C时，折叠效果最好（图5）。
图4 不同温度、不同NaCl浓度下折纸折叠情况
图5 NaCl浓度为50、100、150、250mM时在不同温度下的折纸折叠情况
作者用其他一价盐离子也得到了类似的结果（图6），证实了这种组装依赖于静电力。同时作者成功地制作出其他目标形状的二维折纸，如矩形或笑脸（图7）。
图6 NaCl更换为100mM醋酸钠后25℃的折叠情况
图7 25℃TANa([NaCl] = 100 mM)中折叠出的其他形状折纸
作者使用staple链的过剩量在2 ~ 100倍之间实验，发现在40和100倍时产率最高（图8）。
图8 staple链过剩量在2~100倍之间时折纸的折叠情况
最后，作者发现在25°C下获得的折纸结构在其过量的staple链存在下可以稳定数日，可经聚乙二醇（PEG）沉淀纯化，并且可在没有多余staple链的情况下在TANa中重新分散（图9）。
图9 过量staple链存在的25°C的TANa ([NaCl] = 100 mM)中等温自组装72小时，然后用PEG沉淀纯化一次(左，中)或两次(右)去除多余staple链，在TANa 中再分散，25°C下孵育30分钟(左)或3天(中，右)，得到40倍多余的staple链。
1.3 组装结构应用拓展
然后作者尝试进行原位蛋白功能化，将M13scaffold链、生物素化的staple链、链霉亲和素混合自组装24小时。作者发现大多数生物素位点被亲和素结合，位于折纸结构特定位置（图10）。
图10 原位蛋白功能化示意图及组装结果（左）、结合链霉亲和素的不同组成的有效生物素化位点占比（右）
作者还研究了制备无scaffold链DNA纳米结构的可能性。作者用97个编码组成R4矩形的寡核苷酸链在同样条件下自组装。AFM和凝胶电泳显示，完全折叠的R4矩形的比例随着时间的推移缓慢但显著地增加（图11）。
图11 制备无scaffold链DNA纳米结构示意图及折叠结果
作者还成功获得了更大尺寸的纳米网格（图12）。
图12 自组装纳米网格的示意图及AFM结果
以上结果表明，TANa中的等温自组装是一种静电力驱动的可靠方法，可以在广泛的工作温度窗口内在几小时内生成各种纳米结构，且无论是否有scaffold链，都可以被具有位点特异性的蛋白质原位功能化。
- 三维折纸的自组装
然后，作者探索了该方法在三维折纸中的适用性。作者首先使用p8064 scaffold链和10倍过量的短staple链混合物形成多层边长为57 nm的三角形结构（图13）
图13 3D结构示意图（图源参考文献1）
热退火方法可以得到适当结构（图14a）。在TANa （[NaCl] = 100 mM）中、25℃下自组装48小时，只得到少数三角形结构，但所有都折叠得很好（图14b黄色箭头）。
图14 a,透射电镜下观察热退火方法得到的3D结构；b,自组装方法得到的3D结构
在25°C、[NaCl] = 200 mM或37°C、[NaCl] = 100 mM的条件下进行也获得了类似结果（图15）。
图15 25°C、[NaCl] = 200 mM（左）及37°C、[NaCl] = 100 mM（右）条件下得到的结构
作者用p7560 scaffold链和staple链混合物在200 mM NaCl条件下折叠了一个更密集、由36个螺旋束组成的结构（图16）。同样在100 mM NaCl条件下也能得到结果，但二者产率远低于热退火（图17）。
图16 得到的更密集结构模型及AFM结果
图17 热退火（左）和TANa（[NaCl] = 100 mM）（右）中得到的结构
因此，通过在室温或体温下自组装，可以获得中空或高密度的不同形状三维纳米结构，进一步证明了方法的多功能性。同时，极低的效率突出了其目前的局限性，可能可以通过链设计优化来克服。
- 折叠路径的多重性
为了表征等温自组装的机制，作者设计了一种方法来实时跟踪二维DNA折纸的折叠过程。
首先作者设计了如图的折纸并去除黑色虚线内的A边。作者用胆固醇修饰折纸staple链，在云母板上用脂质双层包被，二者可以在没有镁离子的条件下相互吸附。红圈指出了胆固醇修饰的位点（图18）。
图18 作者设计的折纸示意图
云母板上加入该结构折纸和额外的staple链，在25°C的TANa缓冲液中等温组装。作者观察到，部分是吸附了之后慢慢组装成完整的三角（图19a，白色圆圈）、也有组装好后被吸附的（图19a，蓝色圆圈）、还有组装到一半被吸附的（图19a，黄色圆圈）。
作者对吸附后形成完整折纸的过程详细观察发现，存在明显不同的折叠过程。可以从缺失边的一端合成至另一端（图19b和图19e，过程B），也可以平行于边缘，从内到外（图19c和图19e，过程C）或从外到内（图19d和图19e，过程D）。
图19 a,云母板上观察到的组装结构；b-d,三种折叠过程的详细演示；e,三种折叠过程的示意图。
组装到一半才被吸附的折纸也显示出多种折叠过程，这表明折叠途径的多样性与吸附无关。因此，作者的系统是一个热力学控制的自发过程。
- 最优形状选择和等温形状变换
为了进一步探索这种自组装过程向其热力学最稳定状态自我进化的能力，作者进行了一项竞争实验：将M13 scaffold链与形成三角形或矩形的等量staple链混合，由于三角形结构的scaffold链未配对碱基更少，热力学上更稳定。
作者发现无论孵育时间多久，都没有检测到任何矩形形状（部分或完整的矩形、三角形-矩形嵌合体）（图20），表明该系统能够在复杂的竞争链池中自我选择其最稳定的状态。
图20 竞争实验设计示意图及AFM结果
然后，作者通过热退火制备了矩形折纸，并在没有经任何纯化的情况下另外加入编码三角形的staple链，恒温组装（图21）。
图21 形状转换实验设计示意图
作者发现在30°C下，加上10倍的三角形staple链，矩形逐渐被越来越多的三角形结构所取代（图22，第1行），40天完全消失。也就是说，折纸形状通过大量链取代反应形成了自发的转变。
作者进一步尝试调整转换的效率和速度。为此，作者寻找了矩形结构中的48个staple链，它们连接的矩形scaffold又连上了三角形staple，去除他们的末端碱基，并在最初的系统里用该种缩短的staple链重复实验。
在这种情况下（图22，第2、3行），初始矩形结构更松散，且在1天内全部消失，三角形快速形成且速度随着缩短的staple链（不成对单链）比例的增加而增加。88.1%的折纸4天大致形成三角形。42天后，93.4%的折纸是完美的三角形。
图22 形状转换实验结果
在30°C下使用更高的盐浓度（[NaCl] = 150 mM）可以稳定初始的矩形结构，且必须加入足量缩短staple链才能观察到转换（图23）。[NaCl] = 100 mM、25°C下也相同（图24）。
图23 [NaCl] = 150 mM、30℃下的形状转换实验结果
图24 [NaCl] = 100 mM、25°C下的形状转换实验示意图及结果
将三角形与矩形staple链的比例从10减少到1，即使加入缩短staple链，转换效率也更低（图25）。
图25 改变链比例后的形状转换实验结果
这些结果表明，当存在竞争链，作者的自组装方法可以实现折纸形状自发进化，形成热力学上更稳定的形状。可以通过增加竞争性staple链的比例和添加缩短staple来改变速度。
四、研究结论与讨论
本研究中作者发现了含一价盐的缓冲液系统可以使多组分多种的DNA链混合物在较低的温度下等温自组装，可在广泛的温度范围内（15-60°C），形成多种特定的二维或三维结构，实现蛋白功能化。同时，该过程被证明是热力学驱动的，能在竞争性DNA链混合物中自发选择形成最稳定的形状，或从已成型结构自发地进化为完全不同的结构。
作者的研究拓展了自组装方法的条件与应用，为构建具有进化功能的自适应智能纳米机器提供了一条有价值的途径。
参考文献
[1]Sigl, C., Willner, E.M., Engelen, W. et al. Programmable icosahedral shell system for virus trapping. Nat. Mater. 20, 1281–1289 （2021）. https://doi.org/10.1038/s41563-021-01020-4.
