Nat Commun丨基于竞争crRNA的不对称CRISPR级联信号放大反应用于核酸检测
大家好，今天为大家分享的文献是2023年11月发表在nature communications的一篇文章，题目“Asymmetric CRISPR enabling cascade signal amplification for nucleic acid detection by competitive crRNA”。通讯作者是来自康涅狄格大学的Liu Changchun教授，他的研究主要涉及基于CRISPR系统和合成生物的疾病诊疗，微流控技术用于床旁检测，以及便携智能设备用于诊断。
背景
CRISPR-Cas酶体系目前被广泛用于核酸检测。对于cas12a，其检测靶标局限于dsDNA或ssDNA，需要对靶标进行预扩增，并且在检测范围内无法进行定量检测。
结果
1. Asymmetric CRISPR assay（图1）
作者设计了图1中的实验。不对称的CRISPR系统设计包括两套crRNA（完整大小和分裂crRNA）以及它们对应的靶标核酸。其中，分裂crRNA指的是被分成handle和spacer两部分。作者发现，在存在靶标核酸时，完整大小的crRNA会激活cas12a，然后从cas12a中解离。随后，分裂crRNA可以结合并激活cas12a，从而发生级联信号放大。当体系中不存在靶标核酸时，由于完整大小的crRNA结合了cas12a，会抑制分裂crRNA对cas12a的激活作用。
图1. Schematic illustration of nucleic acid detection by the conventional CRISPR assay and the asymmetric CRISPR assay
2. Full-sized crRNA 和 split crRNA竞争CRISPR反应（图2）
作者首先探究了靶向同一段核酸序列的Full-sized crRNA 和 split crRNA，在同一体系中与CRISPR Cas12a和亲和力。首先，作者设计了两套crRNA，第一套称作target-specific crRNA，第二套称作Competitor crRNA。两套crRNA均设计了Full-sized crRNA 和 split crRNA。结果显示，在同一体系中，Full-sized crRNA与cas12a的亲和力相较于split crRNA更强。两套crRNA的EMSA实验提示，Full-sized crRNA可以调控split crRNA与cas12a的结合，产生竞争性的CRISPR反应。
图2 Competitive CRISPR reaction between the full-sized crRNA and split crRNA.
3. 竞争性crRNA引发的级联信号放大（图3）
经过共同孵育Cy5-full-target、FAM-split-target、cas12a和full-sized crRNA以及split crRNA后，凝胶电泳结果显示：Cy5-full-T 切割不受split crRNA影响；FAM-split-T 切割被full-sized crRNA 抑制；Cy5-full-T 和FAM-split-T 可同时被切割。通过标记Cy5-full-sized crRNA和FAM-split crRNA，page结果显示，由于full-sized crRNA结合并激活cas12a后发生自身的降解，以及cas12a构象改变释放full-sized crRNA，使得full-sized crRNA对split crRNA与cas12a的结合抑制作用得到解除，从而split crRNA可以替代full-sized crRNA和cas12a结合，并引发新一轮CRISPR级联反应。Fig. 3c提示，split crRNA可以在预先激活的Cas12a/Cy5-fullsized crRNA/full-T体系中，与full-sized crRNA竞争结合并激活cas12a。
图3. Cascade signal amplification of nucleic acid detection by compe titive crRNA.
4. 基于RNA/DNA片段组合式target实现cas12a对RNA的检测（图 4）
作者研究了Cas12a/crRNA和ssDNA激活剂、ssRNA/ssDNA靶标在不同组装方式下的切割能力。结果显示，ssDNA 5’-激活剂/ssRNA 3’-靶标不能激活Cas12a，可能是因为ssRNA 3‘-靶标和crRNA上的seed区结合力较弱。有报道指出，PAM附近的5-10nt的seed区对Cas12a识别靶序列十分重要。因此，ssRNA和crRNA的结合位置对Cas12a的切割活性至关重要。随后，作者选择miR-19a作为模型，进行了ssDNA 3’-激活剂/miR-19a 5’-靶标序列的优化和检测，并成功实现了1pM级别的miR-19a检测。
图4. Comparison and optimization of RNA detection of Cas12a using fragmented nucleic acid target.
5. 无需预扩增的miRNA检测（图5）
作者设计了ssDNA 3’活化剂，它可以同时被全尺寸crRNA和分割crRNA识别。然后确定了100 nM LbCas12a、40 nM全尺寸crRNA、10 nM分割crRNA和20 nM DNA活化剂为最佳的反应条件。作者发现，在检测高浓度miR-19a时，有/无分割crRNA的检测结果差别不大。当检测1 fM-10 pM时，有分割crRNA显示出更高的灵敏性，并且在1fM-10pM范围内呈现线性关系，提示可以用于定量检测。另外，全尺寸crRNA与分割crRNA组合的检测体系展示出高特异性。
图5. miRNA quantitative detection by the asymmetric CRISPR assay.
6. 临床样本验证asymmetric CRISPR实验（图6）
作者选择了10例膀胱癌和5例健康人。试剂盒提取总miRNA后，使用asymmetric CRISPR检测，并用RT-qPCR对照。结果显示asymmetric CRISPR可准确诊断，并与RT-qPCR结果相当。
图6. Clinical application of the asymmetric CRISPR assay for amplification-free miRNA detection in clinical samples.
总结
作者提出了一种新的基于cas12a的RNA定量检测方法，无需逆转录和预扩增。作者发现full-sized/split crRNA与cas12a竞争性结合；cas12a可识别RNA/DNA片段化靶标，使得cas12a可以直接检测RNA；该方法检测miRNA的LOD为856 aM，且对于1fM-10pM呈现高灵敏线性的检测特性。文章对该方法的机制进行了深入探究，颇具意义。
