SCIENCE丨阐明溶酶体靶向嵌合体靶向膜蛋白降解的细胞决定因素

今天分享一篇发表在SCIENCE上的文章，题目为“Elucidating the cellular determinants of targeted membrane protein degradation by lysosome-targeting chimeras”，通讯作者是斯坦福大学的Carolyn Bertozzi教授，其实验室专注于分析与癌症、炎症和细菌感染相关的细胞表面糖基化变化，并利用这些信息开发诊断和治疗方法。

近年来，LYTACs、MoDE- As、AbTACs)、PROTABs、KineTACs等靶向降解细胞外蛋白的技术扩大了潜在治疗靶点的范围。这些方法都是利用细胞内化机制来驱动溶酶体中的细胞外蛋白质降解。目前，促进或抑制膜蛋白降解的细胞机制仍不清楚。在这项工作中，作者进行了全基因组CRISPR敲除(KO)筛选，确定了CI-M6PR- LYTAC介导的膜蛋白溶酶体运输和降解的关键决定因素。

工作模式：鉴定LYTAC介导的膜蛋白降解的细胞决定因子

设计包含抗体-糖肽偶联物的下一代LYTACs

为了启动机制研究，基于第一代LYTAC分子的缺陷作者开发了均质肽合成体系，建立了一条合成Fmoc -丝氨酸(M6Pn)-OH单体的合成路线，接着利用无铜点击化学法将含有2个M6Pn (M6Pn₂)或5个M6Pn (M6Pn₅)残基的糖肽类化合物与抗EGFR抗体(Ctx)偶联(图1B)。在UMRC2和HeLa细胞中，Ctx-M6Pn₅和Ctx-M6Pn₂降解了约80%的细胞表面EGFR(图1C)。在UMRC2和HeLa细胞中处理24小时后，超过50%的EGFR蛋白被降解(图1 D和E)。接着，作者将多肽分别与CA9蛋白抗体Gir和c-Met蛋白抗体Ona偶联。在UMRC2细胞中，Gir - M6Pn₅和Gir - M6Pn₂降解了80%的表面CA9，在U87MG细胞中降解了70% - 80%(图1D)。Gir - M6Pn₂能够降解CA9蛋白(图1E)，并且对CA9具有高度特异性(图1F)。接着，作者在五个细胞系中评估了LYTAC的内化，K562具有显著较高的LYTAC介导的内化(图1H)，且内化趋势与各细胞系的细胞表面CI-M6PR表达水平相关。然而，HeLa, UMRC2和HEP3B显示出有效的表皮生长因子受体表面降解，K562细胞后却未观察到EGFR降解(图1I)，表明可溶性蛋白的内化与膜蛋白降解之间缺乏相关性。

图1. LYTACs comprising antibody-glycopeptide conjugates enable degradation of membrane targets.

基于磁细胞分选的全基因组CRISPR筛选确定了LYTAC介导的降解的关键调节因子

磁珠分选技术(MACS)可快速分选出黏附细胞，同时保持较高的细胞活力。为了深入了解膜蛋白的降解，作者利用磁富集技术设计了一种全基因组的CRISPR KO筛查。并通过二代测序确定LYTAC介导的膜蛋白降解所需的基因(图2A)。GO分析表明，Retromer（逆转运）复合体、neddylation途径和M6P生物合成相关的基因都对LYTAC介导的降解有显著影响(图2C)。

图2. Genome-wide CRISPR KO screen identifies regulators for LYTAC-mediated membrane protein degradation.

逆转运复合体基因的破坏通过减少从核内体到质膜的再循环增强了LYTAC介导的降解

作者确定了retromer复合体的核心基因(图3A)，鉴于逆转运基因具有负效应，假设敲除这些基因能够改善LYTAC介导的降解。在VPS26A或SNX3 KO的细胞中，在LYTAC处理后，EGFR的降解显著增加(图3,B和C)。同时，VPS26A缺失未改变CI-M6PR的表面表达水平(图3D)。对比VPS26A缺陷细胞和WT细胞，未观察到LYTAC介导的IgG内化发生变化(图3E)。由于反转录复合体参与了从内体回收货物的过程，因此它可能在LYTAC与受体解离之前部分回收LYTAC-CI-M6PR复合体。作者用Ctx-M6Pn处理24小时，然后洗涤并与新鲜培养基再孵育24小时，观察Ctx-M6Pn的定位。在WT细胞中，LYTAC定位于细胞质膜和部分LE/LY中，而在VPS26A KO细胞中，没有观察到LYTAC定位于细胞表面(图3F)。干扰逆转运基因可以通过消除CI-M6PR竞争性再循环途径来提高LYTAC的效果。

图3. Disrupting retromer complex genes enhances CI-M6PR–mediated target degradation by reducing the recycling of LYTAC–CI-M6PR

CUL3的Neddylation修饰是必需的，并且是LYTAC介导的膜蛋白降解的预测标志物

作者发现了几个casTLE评分高的基因，这些基因参与neddylation修饰和E3连接酶cullin-3 (CUL3)的激活。敲除该通路中的基因(CUL3、UBA3、CAND1)证实EGFR降解依赖于功能性E3类泛素化系统(图4C)。在CUL3缺陷细胞中测试了c-MET的降解，发现c-MET的降解也减弱(图4D)，这表明CUL3的作用不是靶向特异性的。作者用MLN4924作为对照，MLN4924能有效地阻断CUL3的neddylation修饰，并完全消除了LYTAC介导的降解。

为了确定LYTAC介导的依赖于CUL3类泛素化修饰的降解途径的阶段，作者首先观察到，在CUL3缺陷细胞中，CI-M6PR的细胞表面表达没有变化(图4F)。LYTAC处理CUL3缺陷细胞后未观察到总EGFR水平降低(图4C)，但细胞表面EGFR水平相对于未处理对照降低(图4G)。在CUL3缺陷细胞中，LYTACs的结合和内化没有变化(图4 H和I)。因此，CUL3活性是LYTAC介导的内化的下游。作者观察了LYTAC处理72小时后EGFR的定位，发现在CUL3缺陷细胞中，EGFR部分富集在LE/LY囊泡中，而在WT细胞中，EGFR大部分降解(图4J)。因此，CUL3在LYTAC介导的靶细胞从内体成熟到溶酶体降解过程中起重要作用。

为了了解CUL3如何调节核内体向溶酶体的成熟，作者通过免疫共沉淀蛋白质组学鉴定了neddylated CUL3的相互作用分子，最显著的分子是SQSTM1(图4,K和L)。在SQSTM1 KO细胞中，LYTAC降解EGFR的能力降低(图S18, B至D)。在CUL3 KO细胞中，SQSTM1与Ctx-M6Pn共定位(图4M)。CUL3 neddylation修饰对LYTAC活性的关键作用，因此作者比较了11种细胞系的类泛素化CUL3表达水平和EGFR降解能力，发现类泛素化CUL3表达水平较高的细胞系对EGFR的降解更好(图4,N到P)，表明类泛素化CUL3水平可以作为LYTACc介导的膜蛋白降解的预测标志物。

图4. Neddylation of CUL3 is essential for CI-M6PR–mediated target lysosomal degradation.

M6P生物合成基因的破坏可增强LYTAC的疗效

最后，作者对LYTAC介导的降解进行了筛选，确定了几种参与M6P糖蛋白生物合成途径的负效应大小的糖基转移酶，如α - 1,6-甘露糖基转移酶(ALG12)和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPTAB)等(图5，A和B)。在ALG12或GNPTAB KO细胞中，Ctx - M6Pn介导的降解增强(图5C、D)。作者还检测了ALG12和GNPTAB KO细胞中c-MET和CA9的降解，均观察到降解能力的增强(图5E、F)。

图5. Knockout of M6P biosynthesis genes enhances LYTAC efficacy.

M6P生物合成降低CI-M6PR细胞表面可及性

为了阐明M6P生物合成基因的破坏如何提高LYTAC的功效，作者首先评估了摄取，ALG12和GNPTAB KO细胞的摄取显著增加，且内化的货物与溶酶体共定位(图6,a和B)。ALG12或GNPTAB缺失并未导致表面CI-M6PR表达的显著差异(图6C)。接着，作者检测了LYTAC与细胞表面的结合情况。在ALG12和GNPTAB KO的细胞中，LYTAC与细胞表面的结合较高，并且通过与抑制性单体M6P共同处理可减弱LYTAC与细胞表面的结合，这表明这种结合是CI-M6PR依赖的(图6D)。因此，CI-M6PR在稳态下被M6P修饰的蛋白占据。破坏M6P生物合成基因增加了细胞表面可结合的CI-M6PRs的比例，从而增强了LYTACs的内化(图6H)。

图6. M6P biosynthesis attenuates CI-M6PR cell surface accessibility.

总结

该研究的发现激发了针对溶酶体的蛋白质降解剂的新设计策略。基于磁富集的基因组筛选方法可以扩展到任何其他细胞外降解剂，从而可以识别不同细胞外降解平台的共同和不同机制。在该工作中揭示的受体再循环、占用和穿越内溶酶体系统的能力的影响，将对其他依赖于细胞表面与溶酶体运输的治疗具有更广泛的意义，如酶替代疗法、核酸递送和抗体-药物偶联物。