Nat Methods丨时空解析转录组学揭示了亚细胞 RNA 动力学景观

今天要介绍的研究来自麻省理工学院的王潇课题组，发表在2023年4月的《Nature methods》杂志上。

在维持细胞状态和功能方面，基因表达的时空调控非常重要，而这种调控受到mRNA代谢和运输的影响。为了全面理解细胞和组织中基因的调控机制，我们需要系统分析跨时空的转录组。然而，目前的技术在同时捕获RNA图谱的空间和时间依赖性方面还存在一些局限性。

为了克服这个技术难题，麻省理工学院的王潇课题组开发了一种叫做TEMPOmap的全新方法。这个方法很巧妙地结合了脉冲代谢标记技术和多重三维原位测序技术，可以精确地分析单个RNA分子的年龄和位置信息。使用TEMPOmap，研究团队成功地重建了多种人类细胞中RNA从转录、位置到降解速率的动态全景图。通过对单细胞RNA动态参数进行深入的聚类分析，他们发现了“动态基因簇”的表达模式，这些模式是经过多步动态精细调控的结果。重要的是，这些动态基因簇在功能上是相互独立的，并且它们的亚细胞动态特性在不同细胞状态和类型中呈现出独特的调节模式。这一重大发现为我们揭示新的时空调控机制提供了宝贵的线索和方向。

TEMPOmap利用5-乙炔基尿苷（5-EU）对培养细胞进行代谢标记，这种标记给mRNA添加了一种特殊的生物化学标记。研究团队设计了一套特殊的探针，包括splint、padlock和primer，用来特异性地分析每种mRNA物种。他们通过选择性地扩增与这三类探针结合的mRNA的互补DNA扩增子来实现这一目的，从而可以有选择性地检测标记的mRNA群体。为了进行高度多重的转录组检测，研究团队将生成的cDNA扩增子文库嵌入到水凝胶基质中，并进行了几个循环的荧光成像。通过动态退火和连接进行测序，他们可以解码基因编码的条形码。完成循环后，他们对扩增子reads进行配准、解码并进行3D分割。这些步骤可以同时分析成百上千个基因的亚细胞和单细胞。

图1 TEMPOmap实现时空分辨率的转录组学

为了验证5-EU标记示踪的检测效率，研究者进一步进行了实验。在EU处理20小时的细胞中，TEMPOmap的检测效率为STARmap的36%；而在EU处理1小时的细胞中，其检测效率为STARmap的7%。这些数据有力地证明了TEMPOmap在RNA时序动态轨迹分析中的高效性和准确性。

图2 单细胞转录组的时空追踪

为了验证TEMPOmap的数据能否解析单细胞中RNA转录后的动态变化，研究者利用PHATE进行了单细胞动态时序分析。他们发现沿着代谢时间的方向存在明显的时间顺序。此外，根据新生RNA中的标记基因，他们将细胞分成了三个阶段：G1期、G1/S交界期和G2/M期。有趣的是，细胞周期的时间顺序与代谢时间的时间顺序是独立的。这表明TEMPOmap不仅提供了细胞周期的信息，还能提供其他时间维度的信息。

为了更深入地研究这一现象，科学家们生成了单细胞的细胞核和细胞质基因表达矩阵，形成了一个新的核-质基因-细胞矩阵。他们再次利用PHATE进行了单细胞动态时序分析，并绘制了随着时间变化的单细胞时序图谱。在分析过程中，他们发现一小部分的G2/M期细胞形成了一个狭窄的时序，并在特定的空间上呈现出特殊的分布。基于这些细胞的独特核-质分布，研究者推测这部分细胞正在进行有丝分裂。此外，与G2期细胞相比，M期的许多RNA都从染色体区域被驱逐。这表明有丝分裂过程中RNA的亚细胞定位模式可以随着时间的推移而推断。这些结果表明TEMPOmap在解析单细胞中RNA转录后动态变化方面具有强大的能力，为深入研究细胞功能和发育过程提供了有力工具。

图3 TEMPOmap 揭示了整个 RNA 寿命和细胞周期的亚细胞 RNA 动力学景观

为了定量分析不同转录状态的转录组及转录后修饰过程的动力学特征，研究者进一步检测了所有转录本RNA生命周期的关键动力学常数，包括合成速率（α）、降解速率（β）、细胞核输出速率（λ）和细胞质内转运速率（γ）。他们发现，细胞的体积与单细胞RNA Reads数之间存在相关性。在不考虑细胞周期的情况下，体积较大的细胞相对于体积较小的细胞，RNA的合成（α）和分解（β）速度更慢，但细胞质内转运（γ）速度更快。然而，RNA输出（λ）则展现出明显的细胞周期趋势。这表明细胞体积对RNA动力学调节具有重要作用。

进一步对三个细胞周期中4个参数的相关性进行分析，研究者发现在细胞周期重叠区域存在微弱的相关趋势。这表明不同基因的RNA稳态及运输在不同细胞中很少同步，从而增加了RNA生命周期的异质性。这可能是由于基因特异性的或细胞周期依赖性的调节机制。

通过合并所有时间点的数据矩阵，研究者发现了4组共同变化的基因模块。这意味着存在一些潜在的基因共同调节机制。这些基因主要与细胞周期功能相关，而且在相应的时间段内，这四组基因对应的动态特征存在显著差异。这表明在RNA水平上，细胞周期过程中不同的转录或后转录动态特征的基因被精心协调和共同作用。

图4基因功能和转录后特征的差异RNA动力学

为了探究RNA动力学与基因功能之间的关系，研究者使用了12个参数对800个基因进行了聚类。基于基因共享的动力学模式，他们成功识别出了基因模块。进一步分析揭示了5种独特的动力学景观，这些景观由不同的基因类群组成，它们随着时间进程可以通过特征基因表达进行区分，并具有特定的亚细胞分布。

通过基因功能富集分析，研究者发现这5种类群与特定的生物进程和分子功能紧密相关。例如，细胞器的复制和细胞扩张主要在G1期活跃；ER定位蛋白合成可能在G1期更活跃；或者通过RNA转运到内质网或细胞外周的非内质网锚定RNA局部降解。

虽然这些数据背后的具体机制仍需进一步研究，但这些结果强调了调节携带不同遗传信息的转录本的时空定位的重要性。这一发现为我们深入理解细胞功能和发育过程提供了新的视角，并为未来的研究提供了有价值的线索。

图5 TEMPOmap揭示了异质细胞类型的差异RNA动力学

Ren, J., Zhou, H., Zeng, H. et al. Spatiotemporally resolved transcriptomics reveals the subcellular RNA kinetic landscape. Nat Methods 20, 695–705 (2023). https://doi.org/10.1038/s41592-023-01829-8