JACS丨共价核酸适体用于细胞表面PTK7标记
今天分享一篇发表在JACS上题目是“Cell Surface Labeling and Detection of Protein Tyrosine Kinase 7 via Covalent Aptamers”的文章，本文的通讯作者是来自匹兹堡大学的Alexander Deiters教授。他的研究方向包括，化学生物学、化学遗传学、光化学、合成化学和合成生物学。
1.研究背景：
核酸适体是一种对靶标具有高亲和力与特异性的分子工具。在本项工作中，共价核酸适体作为一种新型的生化工具，可快速、选择性将标签转移至靶标蛋白，从而克服共价核酸适体已知的限制。例如核酸适体sgc8c，可选择性地结合特定白血病细胞，且其靶标为PTK7。PTK7是一种无催化活性的跨膜蛋白，其在结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌和宫颈癌等许多肿瘤细胞上高表达。在共价核酸适体的特定位点上引入携带标签的亲电基团，当核酸适体与靶标蛋白结合后，亲电基团与靶标上的亲核基团由于空间距离的缩短，发生共价反应，反应后标签被转移到靶标蛋白上，核酸适体被释放。作者通过共价核酸适体标记了PTK7，并证明了核酸适体介导的生物素转移的位置是PTK7胞外区域上的特定赖氨酸残基，且可通过该标记追踪PKT7。后续研究了共价核酸适体在细胞环境中的适用性及用于癌症检测的潜力。
2.结果与讨论：
首先，通过在sgc8c的特定T位点上引入有炔基修饰的亚磷酰胺单体2，通过与化合物1中的叠氮进行点击化学反应，使得含有生物素标记的亲电基团能够偶联在核酸适体上（图1）。
图1.共价核酸适体结构
作者分别合成了9个不同位点上带有亲电基团的sgc8c候选体，并将这些候选体与重组PTK7在含有5 mM MgCl2、4.5 g/L葡萄糖（pH = 7.4）的DPBS缓冲溶液中37°C孵育1小时。接着使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（SA−HRP）进行免疫印迹实验，以分析生物素转移的效率（图2A）。结果发现当亲电基团修饰在8号、27号、30号位点时，生物素转移的效率最高。在后续实验中，作者选用了修饰在核酸适体的环结构域，与PTK7相互作用潜力更大的sgc8c(27)-1。
接着，作者将0至1 uM的sgc8c(27)-1与100 nM重组PTK7共孵育1小时，发现低至62 nM的浓度下即可观察到PTK7的生物素化，并在浓度为500 nM时达到稳定（图2B），而将PTK7换成牛血清白蛋白（BSA）后，需在500 nM以上才观察到明显的脱靶标记（图2C）。为了进一步模拟生理环境，评估sgc8c(27)-1的脱靶效应，作者在加有胎牛血清（FBS）的DMEM中重复图2C的实验，此时反应环境中存在核酸酶，结果发现同样在sgc8c(27)-1浓度达到500 nM时出现脱靶效应（图2D）。此外，sgc8c(27)-1的降解半衰期t1/2约为63分钟，而它的标记t1/2为86分钟（图2E）。酶降解与标记过程具有相似的动力学，说明这种快速有效的标记转移方法，有望克服目前核酸适体对核酸酶不稳定的限制。
图2.sgc8c(27)-1标记PTK7的浓度与动力学
由于sgc8c(27)-1是通过细胞筛选获得的，因此sgc8c(27)-1有可能将生物素转移到蛋白的胞外区域，因而作者通过质谱测序考察了赖氨酸的反应性。结果表明有两种明确的肽段内含有生物素化的赖氨酸K501和K636（图3）。这些赖氨酸残基位于相邻的非同源Ig结构域（Ig6和Ig7）上。虽然全长PTK7的结构尚未报道，但这两处残基的生物素化表明它们的核酸适体结合状态非常接近。由此说明sgc8c核酸适体的环，很可能是结合在PTK7的第六和第七个Ig结构域处或附近。
图3.生物素化位点
接下来作者对哺乳动物细胞中的生物素化进行了研究，作者构建了PTK-CFP融合蛋白的质粒，从而对PTK7的位置可视化。由于核酸适体和PTK7会在细胞外部偶联并引发生物素转移，因此作者添加了CFP到位于细胞质中的PTK7的C端。作者将表达PTK7或PTK7-CFP的细胞与sgc8c(27)-1孵育了一个小时（如图4A所示），通过链霉亲和素磁珠成功地富集了经过生物素化的PTK7或PTK7-CFP，并利用PTK7抗体进行了免疫印迹实验，结果证明，在细胞环境下，PTK7和PTK7-CFP都能经历生物素化过程。然后，作者验证了在实验条件下实现PTK7生物素化所需的最低核酸适体浓度和最短反应时间。作者在加入了不同浓度的sgc8c(27)-1处理一小时后，检测到PTK7的生物素转移情况，在sgc8c(27)-1浓度为62 nM时，首次观察到PTK7的生物素化，当sgc8c(27)-1浓度为500 nM时，生物素转移达到饱和（图4B）。通过曲线拟合得出EC50值为251 nM，这与之前对重组PTK7实验的结果类似。随后，将250 nM的sgc8c(27)-1与细胞孵育了不同的时间，实验结果表明t1/2为103分（图4C），这与重组PTK7的数据保持一致。
图4.细胞中sgc8c(27)-1对PTK7生物素标记的浓度与动力学
最后，作者研究了共价核酸适体通过内化特异性标记、检测和跟踪PTK7定位以及其癌症检测的潜力。作者将PTK7-CFP转染进NIH3T3细胞，并将细胞与sgc8c(27)-1共孵育1h，随后用四甲基罗丹明（TMR）标记的中性霉素（NA）与细胞短暂孵育5 min。通过观察CFP和TMR荧光成像，作者发现表达有PTK7-CFP的细胞被标记，不表达这种蛋白的细胞则没有被标记（图5A）。在起始点TMR荧光仅存在于细胞膜上，在孵育2小时后，在核内体中观察到TMR荧光，且活细胞成像显示，在标记30分钟内就开始形成内体。作者选用了PTK7高表达的HepG2、Jurkat细胞，和PTK7低表达的HEK293T细胞，与sgc8c（27）-1共孵育，评估标记细胞的归一化平均荧光强度(MFI)时，观察到PTK7阳性细胞的MFI比PTK7阴性细胞增加超过10倍。上述结果表明这种共价核酸适体可用于检测和修饰癌细胞表面高表达的内源性PTK7。
图5.细胞中sgc8c(27)-中追踪PTK7以及癌症检测潜力
3.总结：
作者成功开发出了可切割的亲电试剂的共价核酸适体，不仅可以选择性地标记重组蛋白PTK7，还可以在其天然细胞表面上表达，且在低适体浓度下标记反应快速，为共价适体作为潜在癌症诊断和治疗药物的应用奠定了基础。例如，它们可用于向癌症生物标志物递送多个荧光团，或捕获表达生物标志物的细胞，从而获得更可靠的诊断。通过靶向递送药物到癌细胞，共价适体可以提高治疗效果。
