JACS | 富G序列的不同G-四链体折叠方式：基于规则的预测和蝴蝶效应之间的关系
大家好，今天分享的文献是2023年10月发表在JACS上的 “Showcasing Different G‑Quadruplex Folds of a G‑Rich Sequence: Between Rule-Based Prediction and Butterfly Effect”。通讯作者是格赖夫斯瓦尔德大学生物化学研究所的Klaus Weisz教授。Klaus Weisz教授主要从事G-四链体结构多样性及其选择性药物配体研究。
Dr. Klaus Weisz
研究背景
由富G序列形成的G-四链体结构在生理过程中具有许多重要功能，例如端粒维持和转录调控等。一般情况下，G-四链体的核心结构是由通过氢键连接的G-四分体相互堆叠而成，中心位置的阳离子配位可进一步稳定G-四链体结构。基于序列的可靠三维折叠预测有助于更好地理解G-四链体在细胞和非细胞环境中的功能，但不同G片段（G-tract）之间连接序列的多样性会显著影响结构预测的精确性。
本篇文章研究了含有5个G-tract模式的富G序列（G3-G3-G2-G4-G3），可以预测其为典型的三层G-四链体结构，实验表明在非G-tract结构域的碱基可以引导其进一步折叠成4种不同的结构：篮式反平行G-四链体、具有中断G-tract的平行G-四链体、具有V形环的G-四链体和（3+1）杂交型G-四链体。此外，通过分析其他变体序列的热力学，评估环和悬挂残基的特定关键相互作用来合理化形成的拓扑结构，从而为它们对特定构象异构体的贡献提供有价值的见解。
结果与讨论
ODN1作为母本序列包含G3-G3-G2-G4-G3的经典模式（图1A），并与PDGFR-β核酸酶超敏元件（NHE）启动子序列高度相似。作者首先对ODN1进行一维测定，初步确定了其G-四链体结构的形成（图1B），但核磁峰的个数说明其构象并不单一。为帮助稳定其中具有syn-G的（3 + 1）杂化或反平行G-四链体结构，研究人员在ODN1序列的3、8、15和21号位即每个G-tract中分别引入有利syn-G形成的8 -Br代修饰，一维核磁谱图结果显示3BrGODN1构象几乎单一（图1B）。
图1 实验相关序列及其一维核磁谱图（亚氨基质子区）
另外，将3BrGODN1和母本ODN1的NOESY谱图相叠显示出许多重合的NOE，证明3BrGODN1构象属于母本ODN1的不同构象之一。CD测定确定3BrGODN1形成的是反平行G-四链体结构，通过分子动力学模拟计算进一步解析其为篮式反平行G-四链体（图2），且不同G-tract之间由两个2-nt的侧环以及一个5-nt的对角环进行桥接，此外A1-G14-C10的三碱基平面结构以及位于G-四分体外部的T5与A19之间的Hoogsteen氢键为整体结构提供了额外的稳定作用。
图2 3BrGODN1三维结构表征
接下来，作者尝试确定ODN1形成的第二种主要拓扑结构。根据环内嘌呤和嘧啶碱基对G-四链体稳定性影响的位置依赖性，研究人员将2-nt横向侧环（C18 - A19）的碱基位置互换形成ODN2 序列（A18 - C19）（图1A）。令人惊讶的是，这样的修饰显示出与3BrGODN1亚氨基质子谱完全不同的一维核磁谱图，并且只有少量的次要结构（图1B）。事实上，ODN2和母体ODN1的超强NOE连接性表明ODN2的拓扑结构也是ODN1的主要结构之一。对ODN2的详细结构表征表明，其形成的是一个具有回折环结构的G-四链体，即在第三个G-tract的末端留下了一个空位，该空位由G22通过5-nt回折环填充（图3A）；不同G-tract之间通过两个1-nt的螺旋桨环连接，并且其中一个只桥接两个G-四分体层；此外，在侧环的相互作用下，T23与A18-C19-G20表现出相对无序，而位于5-nt回折环首尾位置的G17和G21形成正反向Hoogsteen碱基对，堆积在3′末端的G四分体平面上（图3D）。
图3 ODN2三维结构表征
根据观察3BrGODN1结构存在一个5′端悬挂残基A，为了评估末端悬挂残基对ODN1拓扑结构的影响，将残基A删去后得到相应的ODN3序列（图1A），ODN3的一维核磁谱图谱峰表示结构也几乎单一（图1B）。随后，同样对其进行结构表征（图4）：ODN3形成的G-四链体结构具有一个1-nt V形环，5′端G碱基位于中间层G四分体上，前面的空缺由G11填充。作者还发现第一个G-T-A环和3′-末端的T碱基形成T-G-A碱基三联体，堆叠在3′-端的四分体平面上，形成特定的氢键相互作用（图4D）。值得注意的是，分别位于第二个和第三个环上的C9和C17形成同源碱基对。此外，一个高度向下场偏移的C17氨基质子共振峰的化学位移大于10 ppm，证明了半质子化的C·C +碱基对的形成。然而，即使降低温度，也不能观察到向下偏移的C17亚氨基质子，这可能是由于溶剂暴露的胞嘧啶的快速交换。
图4 ODN3三维结构表征
最后，为了探究G17·G21碱基对对具有回折环的平行G-四链体稳定性的重要性（图3D），作者对ODN2进行了17位G碱基替换成T碱基的修饰，得到了ODN4序列（图1A）。并在第15位引入溴代修饰可以在保留主要折叠构象的同时抑制次要共存构象，这使得15BrGODN4的结构表征变得简单。CD表征其形成（3 + 1）杂化型G-四链体结构，前面的2-nt螺旋桨环逆时针旋转，后面的4-nt对角线环和3-nt侧线环顺时针旋转(图5A )。碱基A18和C19分别堆叠在响铃的5′端G-四分体平面上（图5D）。
图5 15BrGODN1三维结构表征
综合以上结果表明涉及环和悬挂残基的特定三维相互作用可能是影响整个G-四链体结构折叠方式的关键因素。由于竞争构象的自由能相似，环和悬挂区域内的碱基修饰可能导致不同的氢键和/或堆积作用，并可能成为结构重排的有效驱动力，作者以3BrGODN1和ODN3两条序列为例进行验证。
对3BrGODN1修饰包括14G > T、19A > T和1delA，即要么影响对角环和5′悬挂残基形成的A1-G14-C10碱基对三联体，要么影响连接两个侧环的T5-A19 Hoogsteen碱基配对（图2）。对一维核磁谱图的亚氨基质子谱区分析表明，所有的取代都导致了构象多态性的增加，具有多个G-四链体结构（图6A）。因此，这两种盖层结构对于最稳定的篮式折叠构象似乎是至关重要的。
对ODN3的修饰包括17C > T、17C/18A > A/C、22delT和12C > X，即会影响G3-A5-T22三碱基平面（3′-帽子结构）或C9 · C17同源碱基对（图4）。基于亚氨基质子谱区，3′-侧翼T的缺失触发了次要构象的出现，同时保留了V形环结构，表明该残基对3′-帽子结构的影响较小（图6B）。显然，招募3′端T与G3 · A5碱基对形成帽子结构对V环稳定值的贡献不大。相比之下，涉及C17残基替换的两个修饰导致了相当大的结构多态性，这与ODN3的第二和第三侧环之间的C9 · C17碱基对具有很强的稳定作用相符。可以推测，正是这些环环相互作用促进了该折叠结构的形成。
图6 对3BrGODN1和ODN3的碱基修饰及修饰后的结构表征
核磁共振技术可以提供结构细节和有利的折叠途径，但不能提供特定相互作用的能量贡献信息。因此，碱基替换后G4多态性的增加可能归因于亲本拓扑结构的不稳定和/或竞争结构的稳定。最后，作者通过差示扫描量热法表征ODN1衍生序列的G-四链体的热力学稳定性（表1和2），结果表明关键侧环与悬臂的存在及其相互作用对于稳定G-四链体的拓扑结构具有显著作用，此外8-Br-G的引入有利于G-四链体的特定折叠。
表1 用于热动力学分析的ODN2.1序列及其修饰序列
表2 ODN1衍生序列和ODN2.1及其修饰序列形成G-四链体构象的热力学参数
本篇文章通过对扩展修饰序列进行高分辨率的结构和详细的热力学分析，阐明了特定的分子间相互作用对G-四链体稳定性的重要性，评估了通常不明显的碱基变异对G-四链体主要折叠途径的影响，指出G-四链体折叠的复杂性是由多种微妙的相互作用共同决定的。
