Angew | 通过扩增发夹DNA电路的小分子转换器

  本次给大家分享的是今年发表在Angewandte Chemie International Edition上的一篇文章，题目是Nucleic Acid‐to‐Small Molecule Converter through Amplified Hairpin DNA Circuits.

作者介绍：

文章的通讯作者是东京大学的Akimitsu Okamoto。课题组的研究方向为原子尺度上研究生物聚合物设计与功能，设计有机化学系统，用于识别、转化和可视化感兴趣的生物聚合物中的单个组分或原子。主要的研究工作集中于：①可视化活细胞中核酸分子的行为；②开发靶向特异性化学反应用于捕捉基因关键表达；③合成含有非天然核苷酸和氨基酸的超级生物聚合物，创建新的细胞功能控制系统。

1.背景介绍

MicroRNA是一类长度约为18-24个nt 的非编码的小RNA，最早于1993年在线虫中被发现。在细胞核内，miRNA 基因组在RNA聚合酶Ⅲ的作用下，形成初级转录产物pri-miRNA，后续通过核糖核酸酶RNase Ⅲ（Dorsha）和双链RNA结合蛋白dsRBD，剪切为发夹状前体pre-miRNA，随后被转运蛋白 Exportin5 (Exp5)转入细胞质在各种酶和复合物的作用下达到成熟态。成熟的miRNA装载到RNA诱导的沉默复合物RISC中抑制靶 mRNA 的翻译或是诱导靶 mRNA 的降解，从而调控基因表达过程。

Staudinger反应（如图1），又称Staudinger还原反应，由Hermann Staudinger发现并首先报道。Staudinger反应是叠氮化物与膦或亚磷酸酯反应得到亚胺基膦烷中间体，此中间体再经水解，可得相应的胺和氧化膦，从而提供了一种通过叠氮化物还原制备胺的方法。

Fig.1| Staudinger反应原理。

2.结果与讨论

2.1模型方法

AMC，又称7-氨基-4-甲基香豆素，作为荧光读数；RN是9-羟基-3-异吩恶嗪酮，又称试卤灵，可作为显色读数。DPBM：2—（二苯基膦）—苯甲酰胺，是主要用于Staundinger还原反应的磷化氢。课题组通过NHS-酯和氨基修饰的DNA之间形成酰胺键来制备修饰的DNA结构，HP1-AMC/RN以及HP2-2DPBM，通过识别miR-21引发HCR回路释放和激活功能分子。MiR-21作为靶标识别分子，结合HP1-AMC/RN，形成复合体，暴露出新的结合区域与HP2-2DPBM结合，由于空间位置的邻近，Staudinger还原反应有效进行，同时分子内发生重排，诱导AMC/RN的释放（图2）。

Fig2. | MicroRNA-21 启动HCR释放和激活功能分子。

2.2 HCR回路设计与优化

针对HCR回路进行了新的设计和优化。课题组设计了8nt、9nt、10nt的未修饰小分子的toehold进行比较，通过native PAGE实验验证得出：①8 nt的toehold在加入和未加入miR-21的情况下都未发生扩增，几乎没有启动HCR；②10 nt的toehold，没有miRNA时也存在明显的组装产物条带，具有显著的背景反应；③9 nt 的toehold长度呈现出较好的实验现象。因此后续设计皆采用9nt进行实验（图3）。

实验数据可以看出HCR反应产率并不高，并且剩余显著量的起始发夹。考虑到缓冲液的盐离子浓度对反应具有较大的影响，随后通过实验结果验证可得6 mM Mg²⁺提供最佳效率和选择性（图4）。

Fig3.| 结合区域长度对HCR反应的影响

Fig4.|Mg²⁺对HCR反应的影响

2.3 化学基团的释放与活化

为了证明通过HCR的扩增的小分子活化，课题组首先使用荧光检测以时间进程方式研究通过miR-21添加释放的AMC。随着加入叠氮基-AMC-修饰的HP 1（HP 1-AMC）和2DPBM-修饰的HP 2（HP 2 -2DPBM）的混合物中的miR 21的增加，观察到AMC的荧光强度增加（图5B）。

RN是一种紫色染料分子，其醚衍生物为黄色。RN通过醚键连接到修饰的DNA发夹上，通过从HCR系统释放出自由的RN，溶液颜色由黄色变为紫色，肉眼可观察到（图5E）。通过HCR释放显色基团，实现癌症患者的体液中的miRNA表达水平的简单视觉读出，可构建用于癌症液体活检的miRNA感测装置。

Fig.5| miR-21介导的HCR对AMC和RN的释放和激活

2.4药物释放与活化

响应miR-21激活多种抗癌前药的DNA回路具有高选择性癌症化疗的潜力。SN-38是伊立替康的活性代谢产物，通过抑制拓扑异构酶Ⅰ作用，进而抑制DNA合成和细胞周期， 用于治疗各种类型的癌症。课题组采用催化发夹组装（CHA），选择SN-38作为CHA电路的抗癌读数。MiRNA-21与SN-38修饰的发夹HP 1 '-SN-38结合，暴露出新的单链结合区域，结合修饰膦的HP 2'-2DPBA，置换出miRNA-21，同时发生Staudinger还原释放出SN-38进行治疗。再循环的miR-21链可以继续引发更多轮的HP 1 '-SN-38打开和活化（图6）。

实验设计CHA回路探针HP1’和HP2’，并通过PAGE评估miR-21催化的CHA的效率（图6B）。当不存在miRNA的情况下，显著避免了背景反应（产物产率为0.2-4%）；存在miR-21时，产物有效的形成；催化0.1、0.05和0.01当量的miR-21能够实现有效的CHA反应（产率分别为55、49和35%）（图7B）。

进一步检查了CHA回路的靶向特异性（图7C）。检测了四种生物学相关序列：miR21（1MM）、pre-miR-21、miR-122和miR-785。miR21（1MM）是人工合成含有单个碱基错配的miR-21类似物，Pre-miR-21是含有成熟miR-21序列的前体小分子，miR-122是人类肝脏中丰富的miRNA，miR-7851是数据库miRBase中与miR-21最相似的人类miRNA。pre-miR-21、miR-122和miR-785不能触发HP 1 '和HP 2'的有效CHA，miR21（1MM）只存在微量的非特异性引发。总体而言，除miR-21外，无法触发明显的CHA反应，说明由miR-21催化的回路是高度特异性的。

Fig.6 |通过miR-21催化的CHA回路和Staudinger还原反应放大SN-38的释放和活化

Fig.7|评估miR-21催化的CHA的效率

然后将HP 1 ′-SN-38和HP 2 ′-2DPBM（各0-25 nM）转染到MRC-5、HeLa和MDA-MB-231细胞中（图8A）。其中MRC-5细胞低表达miR-21，而HeLa和MDA-MB-231细胞高表达miR-21。细胞活力测定的结果显示，在富含miR-21的HeLa和MDA-MB-231细胞中，SN-38的细胞毒性以浓度依赖性方式“开启”（图8B）。

进一步确定miR-21催化的CHA和Staudinger还原是否是触发细胞毒性所必需的。未修饰的乱序发夹scrHP’s和未修饰的发夹（HP’s）对MDA-MB-231细胞几乎没有细胞毒性，证实CHA本身不影响细胞活力（图8C）。缺少膦部分的HP1’-SN-38和HP2’的组合，细胞活力恢复，表明Staudinger还原对于SN-38的释放和活化的必要性。此外，scrHP1'-SN-38和scrHP2'-2DPBM的组合对细胞没有细胞毒性，证明了miR-21催化的CHA功能的重要性。

除了SN-38，喜树碱、紫杉醇等药物通过羟基转化为醚而失活，也能适用于设计的CHA回路。

Fig.8| CHA回路释放SN-38的细胞毒性

3. 总结

课题组实现了将miR-21驱动的发夹DNA回路与Staudinger还原反应相结合。该系统能够完成核酸到小分子的转换，能够释放和激活功能分子，以输出荧光、显色和治疗读数。荧光AMC和显色RN通过HCR回路被活化和放大，而治疗性SN-38前药通过细胞中的CHA回路释放活化。同时该系统的输入链不限于miR-21，输出小分子可变，使得该系统适合于应用于各种应用。

Kunihiko Morihiro, Yasuhiro Tomida, Daisuke Fukui, Manami Hasegawa, Akimitsu Okamoto. Nucleic Acid-to-Small Molecule Converter through Amplified Hairpin DNA Circuits. Angew Chem Int Ed Engl. 2023 Oct 26;62(44):e202306587.