Nat Biotechnol | 一种靶向降解癌症相关黏蛋白的黏蛋白选择性蛋白酶设计
大家好，今天给大家分享一篇2023年发表在Nature Biotechnology上的文章，题目为“Design of a mucin-selective protease for targeted degradation of cancer-associated mucins”。
作者简介：
本文的通讯作者是斯坦福大学的Carolyn R. Bertozzi教授，她开创了双正交化学领域，主要研究方向是分析细胞表面糖基化的变化。。
研究背景：
O-糖基化是真核生物中最普遍的糖基化形式。在多种类型的O-糖基化蛋白中，最突出的是黏蛋白（mucins），它主要由上皮细胞分泌，在一系列类型的肿瘤细胞表达，并通过调节蛋白稳定性诱导各种致癌信号分子促进肿瘤进展。StcE是一种选择性切割黏蛋白的蛋白酶。黏液酶可以选择性地从生物样品中去除黏液结构域糖蛋白，并将其切割成片段，便于分析。StcE对黏蛋白表现出基于肽和聚糖的选择性。
靶向蛋白降解(TPD)已成为一种强大的技术作用于不可成药蛋白。为了降解与癌症相关的黏蛋白，作者开发了一种在特定细胞上降解细胞表面蛋白的策略，而不需要内源性降解机制。
结果分析：
1、黏蛋白酶处理破坏黏蛋白驱动的细胞存活
作者首先测试用StcE处理是否会通过破坏黏蛋白的生物物理功能来降低细胞活力。将野生型细胞和过表达MUC1的细胞置于用StcE处理或不处理的超低附着板上，并通过流式细胞术分析其在3天内的存活能力。在无锚定条件下，StcE处理会导致细胞快速死亡。
黏蛋白CD43是白血病细胞上自然杀伤（NK）细胞免疫检查点受体Siglec-7的配体，去除CD43可增强NK细胞对白血病细胞系的杀伤能力。作者使用含或不含内毒素的StcE处理三种白血病细胞系，并将它们与健康的人供血NK细胞一起孵育，然后定量测定其活力。证实了StcE处理会导致细胞表面CD43和整体Siglec-7配体的减少，且脱黏蛋白的白血病细胞易受NK细胞监测的影响。同时，经黏蛋白酶处理后，永生化NK细胞对乳腺癌细胞系的杀伤作用增强。
图1 黏酶治疗逆转癌细胞系中黏蛋白驱动的生存途径
2、StcE的毒性使其需要具备肿瘤靶向性
黏蛋白酶作为注射治疗药物，作者检测了StcE的体内活性和耐受性。在注射15 mg/kg StcE 3小时后对小鼠进行尸检和全血细胞计数（CBC）分析，发现有颅骨下出血、整个胃肠道瘀斑、中性粒细胞在肺中积聚和血小板耗竭的现象。用黏蛋白特异性探针进行蛋白质印迹分析，显示注射0.25 mg/kg的StcE，可在循环中至少保留20小时，并在全身消化黏蛋白，但不如更高剂量时完全。由于内皮细胞和白细胞表面的粘蛋白是凝血和免疫激活途径的关键组分，这些发现证实了具有选择性的工程化黏蛋白酶变体是避免肿瘤脱靶效应所必需的。
图2 StcE在最大耐受剂量为0.25 mg/kg时可在小鼠组织中切割黏蛋白，在更高剂量时表现出全身毒性
3、结构改造降低了StcE的活性和结合特性
作者基于前期研究，设计了一个StcE突变体，使其活性降低、与细胞表面结合减弱，但保留其黏蛋白特异性。作者去除了StcE蛋白的C和INS结构域，对改造的突变体进行表征，SDS-PAGE对重组黏蛋白底物的体外活性进行密度定量分析。为了确定突变体降解活细胞表面黏蛋白的半最大有效浓度（EC50），在37℃使用不同浓度的酶处理细胞1小时，并用流式细胞术评估细胞表面MUC1染色情况。为了确定突变体的有效解离常数（Kd），4℃下在有能抑制酶活性的金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂EDTA存在的条件下，用相同浓度的酶处理细胞30分钟。在后一种情况下，通过抗His抗体与His标记的突变体之间的相互作用来定量结合情况。
图3 结构导向的StcE工程产生了活性、结合和大小降低的突变体
4、纳米抗体-eStcE融合可实现靶向黏蛋白降解
作者设想eStcE靶向癌细胞会逆转生物物理和免疫肿瘤进展途径，同时不影响其它细胞。由于免疫细胞通过Fc受体结合含有Fc的生物制剂，作者创建了一个与纳米抗体基因融合的结构。细胞表面受体HER2在乳腺癌和卵巢癌亚型中表达上调，并且可以和一种已得到充分验证的纳米抗体5F7相结合。将HER2选作靶抗原，经过表达量、稳定性、黏蛋白酶活性和细胞表面HER2结合等方面测试，最终选择ɑHER2-eStcE进行后续细胞和体内试验。作者使用MUC1胞外域构建体转导的细胞来检测纳米抗体和ɑHER2-eStcE中酶成分对粘蛋白结合的影响，实验结果表明ɑHER2-eStcE是通过HER2而非黏蛋白与细胞结合的。
图4 一种优化的纳米-黏液酶偶联物选择性地从HER2+细胞中分离黏液
5、ɑHER2-eStcE选择性杀伤HER2＋细胞
通过一系列混合细胞实验，作者测定了ɑHER2-eStcE是否可以选择性地逆转依赖黏蛋白的肿瘤进展途径。作者在酶处理前将HER2+和HER2-细胞群进行混合，并用混合细胞进行生物物理学和免疫学实验。在无锚定条件下，ɑHER2-eStcE仅逆转HER2+细胞群中悬浮细胞的存活，而经StcE处理会导致两个细胞群中的细胞死亡。同样地，用ɑHER2-eStcE处理能选择性增强NK细胞介导的对HER2+细胞群的杀伤能力。最后，作者在小鼠模型上验证了ɑHER2-eStcE能够选择性降解MUC1进而抑制癌细胞的迁移。
图5 αHER2-eStcE在混合细胞实验和乳腺癌小鼠模型中均有效
总结
作者设计了一种对黏蛋白具有双聚糖和多肽选择性的蛋白酶，通过融合纳米体靶向特定细胞降解细胞表面蛋白。这种蛋白降解不依赖于内源性降解机制，为靶向降解癌细胞表面蛋白提供了新思路，实现对癌症的精准治疗，具有广泛的应用前景。
文献信息
Pedram K, et al. Design of a mucin-selective protease for targeted degradation of cancer-associated mucins. Nat. Biotechnol. 2023 Aug 3. doi: 10.1038/s41587-023-01840-6.
