Nat. Nanotechnol.|Universal, label-free, single-molecule visualization of DNA origami nanodevices across biological samples using origamiFISH
大家好，今天给大家分享的是发表在nature nanotechnology上的一篇名为“通过origamiFISH对生物样品进行通用、无标签、单分子可视化”的文章，作者是加拿大多伦多大学的Leo Y. T. Chou，研究方向为开发自组装分子技术以解决突出的生物医学挑战。
研究背景
DNA纳米结构的设计在细胞相互作用和随后的生物分布中的作用知之甚少，需要一种更加直接的方式追踪DNA纳米结构的分布。目前原位追踪DNA纳米结构的方法，例如荧光染料标记，存在灵敏度低和染料诱导伪影的问题。
DNA纳米结构荧光标记的限制性：
①不反映完整DNA的存在，可能由解离的染料或者降解产物引起
②荧光染料可能与生物分子、细胞和组织相互作用，导致标记结构的生物分布改变。
③荧光染料倾向于序列、PH或ROS依赖性淬灭。
④DNA的染料标记需要在逐个结构的基础上进行验证，这是时间或成本限制的。
⑤染料标记的DNA成像受到引入的荧光标签数量的限制，从而限制体内灵敏度。
文章摘要
作者设计了origamiFISH，这是一种无需标记的通用方法，用于单分子荧光检测细胞和组织中的DNA折纸纳米结构（DNs）。origamiFISH用杂交链式反应探针靶向DNA折纸纳米结构的scaffold序列，以实现1000倍的信号扩增。在DNs摄取一分钟内并在比本领域标准低10000倍的皮摩尔结构浓度下，该技术可识别细胞类型和DN形状特定的时空分布模式。作者还优化了与免疫荧光和组织清除的兼容性，以可视化组织冷冻/振动切片，切片培养和全贴装类器官中的DNs分布。
实验步骤
a.作者将折好的DNA ORIGAMI加到24孔板或者6孔板中，与细胞、组织切片或者类器官孵育。DNs的scaffold均来源于M13mp18噬菌体的7249（nt）的基因组，以及该基因组的变体，包括序列插入（p7308、p7560、p8064和p8634）或缺失（p3024）。DNA按照标准的DNA折纸方案进行折叠，其中M13mp18的scaffold和staple在Mgcl2存在下进行热退火。
b.将跟折纸孵育完的细胞和组织固定在4%的pfa中，使内吞的origami在原位发生交联，然后在70%乙醇中进行膜渗透，使细胞膜的通透性大大增加，用于origamiFISH的探针得以进入细胞。
c.在加热和甲酰胺条件下使DNA变性从而使scaffold和staple解离，随后将origamiFISH探针与细胞或者组织孵育过夜以使探针和sacffold充分结合。使用HCR发夹进行杂交链反应对探针的信号进行放大。
d.得到单细胞、单分子分辨率的origamiFISH染色样品直接在显微镜下进行荧光成像
整个过程在一天之内完成，手动操作的时间约为1.5小时。
图1
实验结果
作者先用RAW264.7细胞验证了实验的可行性。RAW264.7是在折纸领域广泛使用的细胞系，具有高DN摄取能力。使用origamiFISH成像后，DNA在每个细胞内表现为明亮、独特的点状或“斑点”（图1f）。为了分析这些斑点并量化DNs的摄取模式，作者建立了一个图像分析的pipeline，在单细胞和亚细胞水平上执行半自动细胞分割和斑点定量。图1g揭示了即使在同一样本的不同细胞中DN摄取依然具有高度可变性。
图2
随后作者在以往的HCR v.2.0（扩增为625个碱基）的基础上，重新设计了20个分段触发探针HCR v.3.0（扩增为100个碱基），以降低阴性对照（无DNs引入的生物样本）的背景信号（图2a）。为了加速分析进程，作者参考已有的甲醇固定和超高探针浓度的组合优化条件，建立了Turbo OrigamiFISH步骤，可以将1天的反应时间缩短到15分钟（图2b）。尽管与OrigamiFISH相比，Turbo OrigamiFISH的信号点数量明显减少，检测灵敏度降低，但作者认为Turbo OrigamiFISH可应用于DNs的快速高通量设计提供特定的参考平台。接着，为了探究OrigamiFISH的检测灵敏度，作者设计了一个Cy3标记的矩形DN（在一侧装配12个Cy3染料），从而比较统一样本中OrigamiFISH和Cy3染料标签产生的信号（图2c，d）。OrigamiFISH和Cy3染料的浓度梯度与预期一致，DN点的数量随着DN浓度的增加而增加。然而，在所有浓度的分析中，origamiFISH在每个细胞中检测到的DN点明显多于Cy3（图2e），在较低的DN浓度下（1pM）origamiFISH的检测优势更加明显（Cy3染料标签10nM的荧光强度都低于origamiFISH的1pM，图2f）。
为了进一步研究这个体系的检测灵敏度，作者利用生物素-亲和素相互作用将Cy3标记的矩形DN固定在盖玻片上，通过非原位origamiFISH证实origamiFISH可以检测单个纳米结构。为了避免DNs经过溶酶体内吞途径导致修饰的荧光染料被降解，作者将pM数量级的单分散Cy3标记的矩形DN直接微注射到HEK293细胞的细胞质中，然后立即固定以避免DNs被消耗。作者观察到：与常规摄取后的核内体定位的DNs相比，注射进入的DNs的origamiFISH信号在细胞质中稀疏定位且斑点更小，更接近于靶向RNA的smFISH信号（图2g-i）。以上结果证实了origamiFISH在原位和非原位的单纳米结构检测灵敏度较高。
图3
作者分析发现，低origami浓度下FISH和Cy3信号之间的共定位很差。尽管在FISH+斑点中Cy3信号弱可能是由于Cy3检测的灵敏度跟低，但没有FISH+的Cy3斑点的存在就很让人疑惑，这表明DN支架和Cy3短链的潜在解离。为了证明OrigamiFISH在检测细胞中DN稳定性方面具有额外的效用，作者设计并构建了一个新的矩形DN，其中四种单独的组分对应四种不同的荧光染料，通过多光谱成像以确定各个组分是否共定位（图3a，b）。橙色荧光是修饰在staple链上的，蓝色荧光是修饰在scaffold上的，粉红色荧光是scaffold上的HCR信号放大，也就是作者设计的OrigamiFISH，绿色荧光是staple链上的HCR信号放大。在不同DN浓度下摄取30分钟后，实验观察到在低摄取浓度下所有检测成分之间信号共定位的类似损失（图3c）。荧光共定位分析发现，在结构摄取浓度为10pM和10nM之间，所有通道的信号共定位显著减少（图3d）。其中，AF647标记的anti-handle共定位比例下降最为明显，而origamiFISH和由staple引发的origamiFISH之间的共定位信号缺失类似，表明DN支架和staples之间存在潜在的解离。有趣的是，AF594标记的core staples显示出最小的共定位比例降低。由此可见，荧光团标记在core staples是更好的DN荧光成像定位方案，然而，这种荧光标记策略在DN前期设计时存在应用成本过高的问题。因此，origamiFISH和由staple引发的origamiFISH的双重阳性信号可能是检测完整DNs的可行性选择方案。
图4
随后作者选取不同形状和维度（矩形、桶状和长棒状）和细胞系（RAW264.7巨噬细胞和HEK293胚胎肾细胞）探究origamiFISH是否可以解析DN特异性的摄取模式（图4a）。与HEK293细胞相比，RAW264.7细胞在DNs上的摄取效率显著提高，这与其吞噬细胞的作用一致（图4b，c）。此外，我们观察到细胞摄取DN的形状特异性规则，在RAW264.7细胞中，矩形DN的摄取显著增加。在HEK293细胞中，这一趋势被逆转，桶状DN显示出轻微但显著的摄取效率增加。相比之下，RAW264.7和HEK293细胞对DN长杆的摄取明显减少（图4c）。可见，origamiFISH可以实现跨细胞系和DN形状的无标记DN成像，能区分DN形状和细胞类型特异性摄取动力学。
作者在0.2 nM浓度下对所有三种DN形状进行了30分钟(1、5、15和30分钟)的时间过程分析，以突出origamiFISH的检测灵敏度。origamiFISH在DN摄取1分钟后检测到大量的信号积累（图4d）。正如预期的那样，在所有分析的形状中，origamiFISH+ DN点的数量随着摄取时间的增加而增加。此外，DN点随着时间显示相应的大小增加，表明它们在内涵体或溶酶体室中积累。origamiFISH信号在早期时间点(1、5分钟)主要限于膜，随着摄取的进行，内化的细胞内定位点逐渐增加。实验观察到摄取后1分钟内DN内化动力学的高度动态，具有形状特异性差异（图4e）。
图5
随后作者测试了origamiFISH是否可以与抗体辅助免疫标记相结合，以在细胞和组织模型中与蛋白质共定位（图5a）。大多数内化的纳米颗粒聚集在EEA1+早期内体和Lamp H溶酶体。为了观察DN是否遵循类似的细胞内命运，作者在RAW264.7细胞摄取矩形DN 30分钟后，用EEA1或者Lamp抗体对origamiFISH进行共染色。实验观察到origamiFISH与EEA1和Lamp1点之间存在显著程度的共定位，证实了DNs的内切/溶酶体命运（图5b-d）。作者还对类似的样品进行了磷酸组蛋白H3(PHH3)的共染色。PHH3是细胞周期G2和M期晚期有丝分裂的细胞标志物，所以可以反映不同分裂阶段的细胞内吞DN的水平。作者观察到高PHH3表达通常与较低的DN摄取相关，这表明存在潜在的细胞周期依赖性摄取机制（图5e）。这些结果证明了origamiFISH和细胞免疫荧光检测之间的兼容性。
最后，作者进一步探究origamiFISH是否可以用于研究组织中的DN生物学（图6）。作者先将origamiFISH扩展到小鼠引流淋巴结（LNS），这是一种对疫苗接种后抗原螯合很重要的免疫器官，也是纳米疫苗的关键研究点。origamiFISH揭示了区域和细胞类型特异性的DN摄取规则。DN摄取高的细胞(以下简称origamiFISHHIGH)分布在整个LN中，但在B细胞滤泡周围高度富集，DNs被毛囊周围大量细胞吸收，始终显示出大的胞体形态（图6a）。作者进一步证实大多数外周大细胞为F4/80+巨噬细胞，而只有一部分是F4/80+巨噬细胞是origamiFISH+（图6b），这表明LN巨噬细胞内DN摄取能力存在亚型特异性差异。作者还观察到origamiFISHHIGH和F4/80-细胞的例子，表明DN被LNs内的多个细胞群隔离。类似的，作者还证实origamiFISH在其他组织区域(包括肝脏)的检测稳定性（图6c）。
接着，作者在小鼠大脑和人类大脑类器官上进行origamiFISH。由于高脂肪含量、组织自身荧光和广泛的神经突网络，大脑被认为是荧光成像最具挑战性的组织模型之一。于是，作者将桶状DN引入小鼠大脑急性切片培养15分钟，以探测大脑皮层和小脑细胞的摄取特异性（图6d）。在这两个区域，作者观察到在小群体的细胞中稀疏但明显的DN摄取，揭示了DN在神经系统中的分布模式。最后，作者将origamFISH应用于人脑类器官的全贴装制备（图6e），进而揭示了完整的三维类器官内DNs的空间分布模式（图6f）。此外，通过在类器官表面最外层150µm内富集的细胞观察到高DN积累（图6g，上），核周分布表明，这些DNs在细胞内，并不是被所有细胞平均吸收。同时，作者使用冷冻切片和共聚焦显微镜证实，类器官周围细胞对DN摄取的限制并非由于在全贴装制备中缺乏探针穿透（图6g，中）。在类似地摄取DN矩形后，可以看出不同形状的DN的origamFISH信号存在显著的差异性（图6g，下）。
图6
总结
优点：小编觉得这篇文章很吸引人的一点就是图都画得非常漂亮，赏心悦目，让人看到图片就有看下去这篇文章的欲望，只看图片也能把文章的内容表达的很清晰。此外实验流程和设计非常的严谨细致，设计出来的体系实际应用的实操性非常强，效果也很显著。并且作者对不同origami进入细胞以及组织之后的生物分布做了非常细致的研究，第一次提供了如此准确且精确的信息。
缺点：相较于直接荧光成像花费长得多的时间，实验操作也复杂很多，所以如果只是想大概知道一下origami在体内的分布，不需要精确的数据，普通的荧光标记就更加合适。同时因为origamiFISH只针对scaffold链，所以没有办法监测到origami的完整形态，所以就算origami在体内散掉也还是能成像，但是散掉的origami已经无法行使正常的功能。最后一点就是因为使用了pfa固定细胞，所以无法完成细胞内的动态监测。
