Nat Methods丨大斯托克斯位移的荧光RNA 用于活细胞的双发射荧光和生物发光成像

大家好，今天分享的文献是2023年9月发表在Nat Methods上的“ Large Stokes shift fluorescent RNAs for dual-emission fluorescence and bioluminescence imaging in live cells（大斯托克斯位移的荧光RNA 用于活细胞的双发射荧光和生物发光成像） ”。

有关作者：

本文作者是华东理工大学药学院的杨弋教授，课题组的主要研究方向为利用合成生物技术与光遗传学技术控制与监测细胞内分子过程的成像技术开发。代表工作包括发明了一系列特异性检测细胞内核心代谢物NAD、NADH、NADPH、乳酸、过氧化氢的基因编码荧光探针；构建了系列高性能荧光RNA，用于动物细胞内不同种类RNA的标记与无背景成像；发明了简单实用的LightON系列动物细胞光控基因表达系统、RNA代谢控制系统与蛋白质稳定性控制系统，实现了光对哺乳动物组织内基因表达的控制。

研究背景：

• 荧光RNA适体

荧光RNA适体是一类特殊的核酸序列，由SELEX产生，能够折叠成特定三维结构结合处于无荧光状态的配体，形成的复合物能够在激发下稳定地发出荧光。荧光RNA最初由康奈尔大学的Samie R. Jaffrey课题组筛选得到，通过使用有一定二级结构的RNA序列模拟GFP发光机理，赋予RNA类似GFP的功能，并通过对配体和RNA序列的不断优化开发出了一系列模仿荧光蛋白的荧光RNA适体，如Spinach, Broccoli, Corn等。荧光RNA适体被广泛地用于细胞的RNA标记，为活细胞中RNA的可视化提供了一种有吸引力的方法；另一方面，由于RNA序列的可编程性，荧光RNA适体被改造为多种传感器，用于活细胞中的代谢物实时监测。

结果与讨论：

1. 开发小荧光RNA Clivia：

图1. Clivia580 荧光 RNA 的表征。

作者通过模仿人工筛选的具有较大斯托克斯位移的红色荧光蛋白LSS Red的荧光团，设计合成了新的用于筛选荧光RNA适体的荧光团，NBSI（图1a），并在甘油中验证了限制分子内运动的情况下，产生了80 nm的斯托克斯位移。通过SELEX技术，在R8获得了可以显著提升其荧光的适体，并对筛选得到的序列进行突变和截短，获得了长度仅为30 nt的荧光RNA适体Clivia（图1b）。其中Clivia580复合物的激发波长为524 nm，最大发生位于580 nm（图1c），具有较低的Kd（图1d）以及极低的Mg²⁺依赖性（图1e），在哺乳动物细胞中有着良好的应用前景。相比于已得到的大斯托克斯位移适体Chili，其亮度明显增强，且具有更好的信背比（图1f, g）。

2. 拓展荧光RNA Clivia的光谱范围：

图2. 具有大斯托克斯位移的Clivia 荧光 RNA 调色盘。

与HBC（与荧光RNA Pepper结合的配体）相似，NBSI具有典型的发色团结构：通过π共轭连接的电子供体和电子受体。通过引入不同的官能团调节发色团中电子受体的强度或同时调节电子供受体的性能（图1a），作者获得了一系列均可以与Clivia结合的NBSI类似物，并且改变了复合体的最大发射波长（图1b）。全部NBSI类似物都能够适用单光子和双光子显微镜，在细胞成像中显示出良好的性能，获得的最大发射波长为624 nm（图1c, d）。

3. 在哺乳动物细胞中利用Clivia对snRNA进行标记成像：

图3. 在哺乳动物细胞中利用Clivia对snRNA进行标记成像。

经过合理进化的Clivia仅有30nt，其大小对于活细胞中small non-coding RNAs的标记有着天然优势，能够最大程度上降低插入序列过长对RNA定位的影响。作者将Clivia与不同的ncRNAs（7SK RNA，U6 splicing RNA, mgU2-47 Cajal body RNA）融合，并且通过成像确定了其在活细胞中的定位（图3a）,并不因Clivia的插入而发生改变。同时，作者观察了Clivia-U1在细胞中的动态变化，在加入药物刺激后与SMN1相互作用（图3c），发生液液相分离，表明Clivia适用于活细胞中ncRNA的标记，有利于其时空动态性的进一步研究。

4. 利用Pepper和Clivia对基因组位点进行双色成像：

图4. 单激发双发射用于基因位点双色成像。

作者通过体外和体内实验首先证明了Pepper-HBC复合物与Clivia-NBSI复合物具有良好的生物正交性，并且由于Clivia具有大斯托克斯位移的性质，非常适合用于单一激发（488nm）双发射（Pepper497，Clivia595）进行双色成像。作者将Pepper和Clivia融合于sgRNA的tetraloop处（图4a），对其进行标记。共表达dCas9-SNAP和靶向centromere的Clivia标记（或靶向telomere Pepper标记）sgRNA在活细胞成像中分别观察到约40个红色点状信号和80个绿色点状信号，并且均与SiR标记的dCas9显示出良好的共定位现象（图4b）,并且共表达两种标记的sgRNA不会发生相互干扰，均具有理想的成像效果（图4c）。作者接下来将双色成像系统用于标价不同的染色体重复序列来揭示染色体内或染色体间的基因位点距离，图4d表明，随着目标基因位点在染色体上间隔的降低，成像出的信号点距离也逐渐降低，直到完全重合。通过单标和双标，双色标记系统可以很好地实现对于三个不同基因位点（C9-2, C13-1，C19-1）的同时标记（图4e）。由此可以证明，作者构建了一种简单稳健的成像方式，用于CRISPR系统的RNA标记，能够在活细胞中同时实现多个内源基因位点的成像。

5. 利用生物发光成像对蛋白质-RNA相互作用进行检测：

图5. 利用生物发光成像对蛋白质-RNA相互作用进行检测。

Clivia的激发光谱与NanoLuc利用对应底物产生生物发光的发射光谱有着较好的重叠（图5a），理论上若Clivia与NLuc在空间上的距离较近，NLuc的激发态能量能够通过BRET激发Clivia，用于RNA-蛋白质相互作用的实时检测。首先，作者利用MCP-MS2对其进行概念验证，Clivia-MS2与NLuc-MCP的相互作用是否能引发BRET（图5b, c），在细胞中共表达MS2 RNA和MCP蛋白，通过计算BRET比例证明了该体系可以进一步用于RNA-蛋白质相互作用验证（图5d）。为了更好地应用此体系，作者对融合蛋白的linker长度以及MS2与Clivia的核苷酸连接长度进行优化以获得更高的BRET效率，在细胞和动物实验中均得到了验证（图5e-k）。此外，作者还用过该设计验证了不同ssRNA变体与ZRANB2蛋白的亲和力可以通过BRET效率进行验证（图5m-n），说明NLuc-Clivia为RNA-蛋白质相互作用的验证提供了有力工具。

总结：

1.作者筛选得到了荧光RNA Clivia，比已报道的荧光RNA更稳定、更亮，具有更大的斯托克斯位移。

2. 荧光RNA Clivia的荧光团NBSI 及其类似物表现出低背景荧光、良好的膜通透性和低细胞毒性。荧光RNA Clivia与Pepper共激发时可提供明亮的信号，无需使用两个激光即可在活哺乳动物细胞中进行双色RNA成像。虽然激发仍然在绿光和蓝光激发，但是发射光谱可以得到橙色到红色范围。

3.Clivia能够实时跟踪和监测RNA颗粒中的RNA分布和动态、用于基因组位点的多重成像以及活细胞中 RNA-蛋白质相互作用的检测。

文献信息：

Jiang, L., Xie, X., Su, N. et al. Large Stokes shift fluorescent RNAs for dual-emission fluorescence and bioluminescence imaging in live cells. Nat Methods 20, 1563–1572 (2023). https://doi.org/10.1038/s41592-023-01997-7