NAT BIOTECH丨血浆核小体表观遗传标记用于结直肠癌诊断
大家好，今天为大家分享的文献是2022年9月发表于Nature biotechnology上的题为“Multiplexed, single-molecule, epigenetic analysis of plasma-isolated nucleosomes for cancer diagnostics”。
作者简介：
通讯作者是来自于以色列魏兹曼科学研究所的Efrat Shema教授。Efrat Shema课题组致力于研究表观遗传失调在癌症中如何促进肿瘤的发生和发展，在基因组学和蛋白质组学的界面上开发方法，应用创新的单分子和单细胞技术，深入理解染色质调控，并开发用于癌症早期检测的新型诊断工具。
研究背景：
基于游离细胞DNA（cfDNA）分析的非侵入性液体活检方法提供了新一代的诊断方法。健康个体中的cfDNA主要来源于正常死亡的血细胞，而癌症个体中，有一部分cfDNA来源于肿瘤细胞，称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。
血浆中的cfDNA主要以核小体（cfNucleosomes）的形式存在，是染色质的基本单位，由150bp的DNA围绕核心组蛋白八聚体组成，维持着组织和癌症特异性的表观遗传状态，可以提供丰富的表观遗传信息，为揭示肿瘤分子图谱提供了新思路。然而目前大多数的分析检测方法样本需求量大、检测范围有限、成本较高，同时获得的信息有限，且分辨率较差，通常只能得到单一的观测信息 (如单一的DNA甲基化或者一种组蛋白修饰)。因此，急需建立高分辨率的、能够整合不同层面信息的检测方法。
结直肠癌是全球常见癌症，患者死亡率高，肿瘤转移是患者死亡的主要原因，早期筛查和诊断对于改善患者预后至关重要。常规的检查方法如肠镜和组织活检是侵入性的，过程痛苦且存在风险。因此，需要发展更有利于临床开展的结直肠癌检测方法。
结果分析：
- EPINUC解码血浆cf核小体的组合表观遗传状态
cf核小体的样品制备过程
本文基于单分子系统开发了血浆分离核小体表观遗传学的技术（EPINUC），通过TIRF显微镜（全内角反射荧光显微镜）成像组蛋白组合修饰。开发了高效的酶反应荧光标记核小体并添加poly-A尾巴，通过杂交将其固定在聚乙二醇表面上，并用荧光标记抗体结合TIRF成像记录其翻译后修饰（PTM）的状态。
EPINUC方法检测多种组蛋白修饰
每个血浆样本的核小体都有Cy3（绿色）标记，并用AF488（青色）或AF647（红色）标记的三个抗体对组合成像，因此获得六个组蛋白PTM的多参数数据。作者通过检测发现CRC患者中H3K27me3和H3K4me4的含量显著增加。
- 癌症相关生物标记物和肿瘤特异性蛋白的多重检测
检测生物标记物的实验原理
为了将所测分析物的数量扩展到组蛋白PTM以外，研究团队开发了用于蛋白质生物标记物定量的单分子系统。调整了表面标记使之包含PEG链霉亲和素，从而锚定靶向血浆蛋白的生物素标记的抗体。与血浆孵育后，结合蛋白通过检测荧光抗体成像。
TIRF 成像 CEA (red), MST1 (cyan) and TIMP1(green)
通过使用不同的荧光团，实现了三种生物标记物的多重同时检测。研究团队成像了两种已知在CRC患者血浆中增加的蛋白质：癌胚抗原（CEA）以及TIMP1，此外还检测了MST1，MST1是一种细胞增殖的抑制剂，在CRC患者中降低。
TIRF 成像 p53及 mutant p53
作者还探索了该方法是否也可以量化传统技术无法检测到的非分泌肿瘤特异性血浆蛋白，比如肿瘤抑制因子p53，经常在CRC中突变。研究团队从血浆中捕获p53，并用两种不同的抗体同时检测，一种可以同时结合野生型和突变型p53的抗体，另一种只特异性结合突变型的抗体。结果显示在确诊有CRC患者血浆中观察到较高水平的总p53和突变p53，从而建立了系统对直接来源于肿瘤细胞的突变蛋白的特异性检测能力。
单分子成像DNA甲基化原理图
DNA甲基化通常在癌症失调，特别是在CRC中。因此，研究团队接下来将分析方法与血浆中DNA甲基化水平的定量单分子检测相结合。他们用MBD2–biotin特异性捕获甲基化的cfDNA成像。结果显示，CRC患者血浆中cfDNA甲基化水平下调。
- EPINUC揭示了CRC晚期癌症中的多种表观遗传及生物标记物改变
TIRF 成像 CRC患者及健康人血浆样本中的蛋白标记物
作者接下来用EPINUC从33份健康人血浆样本和46份来自40名晚期CRC患者的样本（第III、IV阶段）中生成由三层信息（组蛋白PTM、DNA甲基化和蛋白质生物标记物）组成的高维数据。与临床诊断结果一致，CRC患者中CEA显示出较高的水平，并且在切除后患者中也观察到CEA水平的降低。同时检测MST1（一种抗增殖因子）得出CEA/MST1比值，可以更好地对样本进行分类，并突出了组合生物标记检测的优势。
各种组蛋白修饰、DNA甲基化在晚期CRC患者和正常人中的显著差异
作者还分析了cfNucleosomes总数、六种组蛋白PTM、它们的成对组合和比率的定量测量。与文献报道一致，CRC患者血浆cfNucleosome小体含量高于健康对照。在CRC患者中，H3K9me3-和H3K36me3-修饰核小体的组合模式减少，伴随着以H3K4me3和H3K27me3标记的“二价”核小体增加。由于二价染色质在许多类型的癌症中都有密切关联，这一结果进一步证实了组合组蛋白标记的单分子定量的诊断价值。CRC样本中的DNA甲基化降低，与之前的研究结果一致。
- EPINUC揭示了CRC早期癌症中的多种表观遗传及生物标记物改变
CRC早期患者多种表观遗传的改变
受上述CRC晚期患者检测结果的鼓舞，作者又将EPINUC方法应用于17个早期CRC患者的血浆样本检测。与后期一样，早期癌症患者和健康人之间的DNA甲基化水平、CEA和CEA/MST1比率存在显著差异。值得注意的是，I、II期CRC患者血浆中H3K27me3-和H3K9me3-修饰核小体的水平也升高，H3K4me1和H3K9ac的组合含量低于健康人。这些结果表明在早期CRC中已经发生了各种表观遗传改变。
- 机器学习CRC分类模型
各种预测模型的AUC
最后，为了整合所有测量值并区分健康和CRC样本，研究团队使用了机器学习分类。最佳预测模型显示出较高的诊断潜力，其曲线下面积为0.96（AUC；95%置信区间（CI）为0.945–0.975），灵敏度为92%（95%置信区间为89.3–94.7），特异性为85%（95%置信限区间为80.2–89.8），精密度为92%（95%可信区间为89.7–94.3），且这种高分辨能力不包括DNA测序，而是通过联合多个参数包括组蛋白PTM、DNA甲基化、多种蛋白质生物标记物实现的。
- EPINUC–seq确定肿瘤组织的起源
EPINUC–seq 原理图
由于不同的组织表观遗传修饰不同，作者猜想通过机器算法引入测序可以检测cf核小体的组织起源，从而揭示癌症的起源。故作者将EPINUC和单分子DNA测序结合。简单来说，检测组蛋白PMT后，组蛋白被驱逐，DNA通过使用自动流体系统进行合成。每个周期由DNA聚合酶结合A、C、T或G和成像组成;经过120个循环，这些数据被整合成一条可以与基因组对齐的链，对应于修饰核小体的位置。
CRC患者的H3K27me3结肠中ChIP-seq谱重叠
作者将此方法应用于检测晚期CRC血浆样本的H3K4me3、H3K27me3或H3K9ac。发现血浆样品与结肠特异性H3K4me3、H3K27me3和H3K9ac峰有显著重叠，表明结肠是主要的起源组织。
总结与讨论：
分析血浆核小体的主要挑战是（1）微量（即1毫升血浆中有1000个基因组拷贝)；（2）血浆含有高密度额外的蛋白质，使酶法或结合方法难以捕获核小体；（3）不同个体之间有很大的差异，强调需要定量方法来实现样本之间的比较；（4）需要多参数数据来实现检测的高特异性和置信度。为了尽量克服以上挑战，该研究团队开发了一种单分子多参数分析方法（EPINUC），以全面描述血浆分离核小体的表观遗传学、DNA甲基化和癌症特异性蛋白生物标记物。该检测技术可从小于1mL的血液标本中获取临床相关的多维度信息，有望实现结直肠癌精准诊断，并可能拓展应用于多种癌症、自身免疫病和心脏病等疾病的诊断中，成为传统检测方法的补充或替代工具。
文章来源：
Fedyuk V, Erez N, Furth N, et al. Multiplexed, single-molecule, epigenetic analysis of plasma-isolated nucleosomes for cancer diagnostics[J]. Nature biotechnology, 2023, 41(2): 212-221.
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01447-3
