Nature Nanotechnology | 胰岛素-DNA折纸纳米结构激活多价胰岛素受体
今天分享的是近期发表在Nature Nanotechnology上的一篇文章，标题为Multivalent insulin receptor activation using insulin–DNA origami nanostructures。
有关作者：
本文的通讯作者为瑞典卡罗林斯卡学院Ana I. Teixeira，该课题组的主要研究方向为采用多学科方法，包括材料科学，生物物理学和细胞生物学，理解细胞与微环境之间的相互作用。
研究背景：
自从 100 多年前 Banting和Best发现肽类激素胰岛素以来，它一直是研究者深入研究的对象，具有重要的医学意义。目前，胰岛素作用的基本机制已经明确，胰岛素与胰岛素受体(IR)结合诱导构象变化，导致受体自磷酸化，启动下游信号级联，最终导致细胞内葡萄糖摄取、脂肪生成、糖生成和其他合成代谢、生物合成过程。近年来，对胰岛素结合的结构细节和相关的IR构象变化已经被阐明。自20世纪70年代以来，IRs就被报道在细胞膜上形成纳米团簇，如在脂肪细胞、β细胞和肝细胞。然而，对IRs的研究主要集中在单个配体-受体相互作用上，很少考虑细胞膜上受更广泛的纳米级组织。
用结构明确的配体纳米簇而不是单个配体靶向受体纳米结构域，为控制受体介导的信号反应提供了全新的可能性。DNA折纸纳米结构已经用于控制配体的纳米级空间分布和调节受体介导的信号传导，例如EPH、PD-1、MET、TLR9、FcγR、B细胞和T细胞受体。重要的是，DNA折纸纳米结构能够直接控制配体效价构建配体纳米簇和受体纳米域之间亲和力效应的产生。
本文，以脂肪细胞作为模型系统，描述了细胞膜上 IR的纳米级空间组织。基于此来指导胰岛素纳米簇的设计，探索胰岛素效价和空间组织对体外和体内 IR 信号传导的影响。
结果与讨论：
1. IR 被组织成纳米团簇
在胰岛素靶细胞类型中，脂肪细胞培养物作为具有生物学相关性、稳健且均匀的系统来研究胰岛素信号传，分析其细胞膜上胰岛素受体（IR）的纳米级排列。 DNA-PAINT 技术观察到形成的IRs纳米团簇平均粒径为74 nm，每个簇包含大约 31个定位，表示每个簇有3到4个IR。用10 nM的胰岛素处理后，纳米簇直径增加到84 nm。IR簇在对照组和胰岛素处理的脂肪细胞细胞膜上的分布相似。证实了IR在细胞膜上以簇形式存在，即使在胰岛处理后仍然基本保持。
图1. IRs在细胞膜上被组织成纳米簇
2. 具有明确胰岛素间距和价的胰岛素纳米棒
DNA折纸能够精确设计纳米级形状，并在指定位置呈现单链DNA（ssDNA），通过生物分子结合的互补ssDNA链进行寻址组装成纳米图案。研究人员选择了长度为140 nm的18螺旋 DNA 折纸管（NanoRod），与胰岛素受体 (IR) 纳米簇的尺寸相匹配。在沿着纳米棒的位置设计了一排潜在的ssDNA位点与胰岛素- DNA偶联物（INS-DNA）相互作用形成胰岛素-NanoRod，构建了具有不同胰岛素分子密度的胰岛素纳米棒0 (NR), 1 (NR-1), 2 (NR-2), 4 (NR-4), 7 (NR-7)和15 (NR-15)。琼脂糖凝胶电泳和动态光散射证实了不同胰岛素纳米棒的完整性和相似的粒径。DNA-PAINT成像验证了预期的胰岛素结合位点，尽管每个结构的胰岛素分子的实际数量略低于设计规格，特别是对于更高的化合价。
图2. 具有可编程胰岛的胰岛素纳米棒
3. 胰岛素效价控制在IRs的停留时间
采用表面等离子共振 (SPR)，利用固定在传感器芯片上的二聚化 IR 胞外结构域 (ECD-IR)，研究了胰岛素NanoRods与IR的结合动力学。胰岛素和胰岛素在纳米结构之间的结合动力学上的明显差异;与INS-DNA相比，NR-7表现出极低的解离常数，这导致停留时间要比INS-DNA高出大约三个数量级。此外，SPR分析也表明，NR-7与胰岛素一样，与IGF1胞外结构域的结合程度极低。结果表明胰岛素 NanoRods与ECD-I特异结合并受胰岛素效价的影响。
图3. 胰岛素在纳米棒上的效价决定了IR结合的停留时间
4. 胰岛素效价和间距决通路的激活
采用具有不同效价的胰岛素纳米棒研究了其对培养脂肪细胞中胰岛素受体 (IR) 激活的影响。结果表明NR-7表现出最强的激活作用，IR 和 AKT 磷酸化均达到峰值。然而由于DNA折纸纳米结构的配体呈现通常与配体与细胞结合的减少有关，导致NR-7的磷酸化水平低于未修饰的胰岛素。NR-15尽管化合价较高，但显示出 IR 激活降低。
为了研究胰岛素间距对IR激活的影响，研究者设计了一系列不同效价但间距为7 nm和14 nm的胰岛素纳米棒。对于这两种j间距，增加胰岛素效价导致IR磷酸化增加，分别在NR-7 (7 nm)和NR-4 (14 nm)处达到饱和。AKT磷酸化水平也随着价态的增加而增加，最高可达NR-4 (7 nm)和NR-7 (14 nm)。重要的是，与NR-7相比，NR-7 (7 nm)处理导致IR和AKT磷酸化水平降低，证实了7 nm间距不是促进IR激活的最佳选择。上述结果表明胰岛素效价和间距控制着IR激活水平。
图4. 胰岛素在纳米棒上的效价和间距影响IR通路的激活
研究人员还采用mRNA测序比较了NR-7多价胰岛和NR-1单价呈递对脂肪细胞转录反应的影响。与对照组相比，100 nM未修饰的胰岛素导致大约2200个差异表达基因 (DEG)，而10 nM则几乎没有DEG。10 nM胰岛素的NR-7和NR-1均引起大量DEG，其中很大一部分（91.5%，2841 个基因）的胰岛素调节基因也受到NR-7的调节，只有57.5%（1372个基因） 受到NR-1 的影响。研究人员还检测了对脂肪细胞胰岛素代谢反应至关重要的转录因子 SREBF 和 FOXO。与 NR-1相比，NR-7诱导与脂肪生成和脂滴组织/储存相关的 SREBF1靶基因的更高表达。此外，NR-7下调 Pnpla2 和Adipoq的表达，FOXO1的靶基因与胰岛素刺激呈负相关，而NR-1则没有。研究结果表明与单价胰岛素相比，多价胰岛素呈递会导致更强IR通路激活和转录反应。
图5. 胰岛素在纳米棒上的效价调节转录反应
当胰岛素-纳米棒注射到消融β细胞数量的斑马鱼幼虫中时，纳米结构对 β细胞数量没有显著影响。然而，NR-7K-PEG显著降低了游离葡萄糖水平，低于对照 (NRK-PEG)，而 NR-1K-PEG并未表现出显著效果。这表明多价胰岛素的存在促进了斑马鱼模型中游离葡萄糖水平的降低。
图6. 胰岛素在纳米棒上的价态决降低β细胞切除斑马鱼幼虫游离葡萄糖的能力
结论：
通过胰岛素纳米簇的价态和几何结构控制IR介导的反应，而不是改变胰岛素浓度或改变肽的化学性质，并可能为开发治疗糖尿病的新药提供一个起点。
Joel Spratt, José M. Dias, Christina Kolonelou, Georges Kiriako, Enya Engstrom, Ekaterina Petrova, Christos Karampelias, Igor Cervenka, Natali Papanicolaou, Antonio Lentini, Bjorn Reinius, Olov Andersson, Elena Ambrosetti, Jorge L. Ruas and Ana I. Teixeira. Multivalent insulin receptor activation using insulin–DNA origami nanostructures. Nat. Nanotechnol. 2023. https://doi.org/10.1038/s41565-023-01507-y.
