JACS丨 Small-Molecule Aptamer for Regulating RNA Functions in Mammalian Cells and Animals

今天我要分享的是一篇发表在JACS上的文章，发表日期为2023年4月12日，题目是《Small-Molecule Aptamer for Regulating RNA Functions in Mammalian Cells and Animals》。

关于作者：

这篇文章的通讯作者是来自冲绳科学技术大学核酸化学与工程系的Yohei Yokobayashi教授。他的研究方向包括应用高通量测序来分析和设计核酶，以及在哺乳动物细胞、病毒、细菌和人工细胞中开发和应用核糖开关，并设计DNA自组装装置。

研究背景：

精确调节哺乳细胞中基因表达对于基础研究、代谢工程和基因/细胞疗法等实际应用具有重要价值。传统方法通常使用基于转录因子的基因开关来调控基因表达，尽管这些方法在基因调控能力方面表现出良好的特性，但在应用方面存在一些缺点，如免疫原性、基因较大以及需要工程启动子等问题。

核糖开关是一种新型的基因表达开关，不依赖外源蛋白质，主要由RNA适体组成。通过RNA适体和小分子结合产生的结构变化，可以通过多种机制来调控基因表达。虽然可以通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）在体外筛选出与各种小分子结合的RNA适体，但并非所有筛选出的适体都适用于细胞环境或作为核糖开关的一部分。此外，大多数核糖开关需要较高浓度的小分子（约100 μM或更高）来激活，因为大多数小分子在细胞中的生物利用度较低，且适体-小分子结合并非在细胞中最优。

因此，本文的作者旨在开发一种具有更好细胞渗透性和低细胞毒性的小分子及其RNA适体的核糖开关，以更高效地调控哺乳细胞基因表达。。

RNA适体筛选及优化：

     在该研究中，作者选择了ASP2905及其衍生物ASP7967作为配体小分子，并将它们固定在含有氨基的琼脂糖珠上进行SELEX筛选。ASP2905最初用作钾电压门控通道亚家族H成员3（KCNH3）的抑制剂，用于研究其对动物认知能力的影响，目前正在进行针对阿尔茨海默病和精神分裂症的Ⅰ期临床试验。

图1. R10-6与AC17-4的序列。

作者进行了10轮的筛选，并对最后四轮进行了高通量测序分析。从中选取了R10-6序列，并从该序列中确定了具有结合能力的最小基序AC17-4。作者通过表面等离子共振（SPR）测定，发现AC17-4与ASP2905和ASP7967在25℃下的结合强度（KD）分别为7.7 nM和12 nM。此外，通过等温滴定量热法（ITC）测定，作者发现AC17-4与ASP2905在37℃下的结合强度（KD）为48 nM。

这些结果表明，AC17-4具有与ASP2905和ASP7967结合的能力，并且在不同温度下的结合强度也有所差异。这为进一步优化和应用这些RNA适体提供了基础。

表1. SELEX使用的实验条件。

图2. SPR（左）和ITC（右）测得的亲和力强度。

在该研究中，作者使用表面等离子共振（SPR）技术对AC17-4进行了突变分析，以研究不同突变对其与小分子的结合亲和力的影响。图3显示了不同突变对亲和力的影响。

作者发现，单个碱基突变G2C、A3U、G4C、A5U、G6C、C20A、U34C和U34G对亲和力产生明显影响，这表明这些碱基对在适体的结构和/或与小分子的结合中起着关键作用。另外，将L2和L4替换为UUCG并不会导致亲和力的丧失，这表明这两个碱基不参与适体和小分子之间的三级相互作用。而将碱基对M9和M11进行替换会对亲和力产生负面影响。

尽管作者研究了影响适体和小分子相互作用的因素，但并没有进一步进行优化。这意味着还有进一步的研究和优化工作需要进行，以改进适体的结合亲和力和细胞渗透性，从而更有效地调控基因表达。

图3. 基于SPR对AC17-4的突变分析。

哺乳细胞中基于AC17-4调控基因表达：

在哺乳动物细胞中，调控基因表达的一种常见策略是在mRNA的非翻译区（UTRs）插入一个或多个变构自切核酶（aptazymes），这些核酶可以通过自切割来降解或抑制mRNA的表达。在之前的研究中，作者开发了一系列基于手枪核酶（CPP）的系统，用于调控哺乳动物细胞中的基因表达。在本研究中，作者将原本CPP的5'端和3'端连接起来，并在其中插入AC17-4序列和与P1中绿色部分互补的序列（Anti-Rz），同时打破原有的L3末端，用于连接下游需要表达的基因（图4）。这种设计思路是，当没有小分子存在时，核酶具有活性可以自切割从而抑制基因表达；但是，当加入小分子后，适体-小分子结合会导致变构效应，使得Anti-Rz与P1互补，抑制核酶的活性，从而促进基因表达。由于该开关的性能与Anti-Rz序列的长度有关，作者通过筛选确定了8个核苷酸长度的Anti-Rz序列具有最佳性能。通过计量依赖性实验验证发现，10 μM的ASP7967可以达到饱和，EC50约为2.3 μM。

图4. CPP系统用于调控哺乳动物细胞中基因表达。（A）CPP结构及自切割位点（B）作者设计的CPP系统及筛选的互补序列。

小鼠体内基于AC17-4调控基因表达：

      作者为验证核糖开关在体内的功能，用AAV载体调节小鼠体内hEPO的表达水平，其中hEPO可用于治疗与慢性肾脏疾病相关的贫血，代表了一类可能受益于基因治疗载体的化学调节表达基因。

图5. AAV结构及在HEK293中的验证结果。

作者首先在HEK293细胞中进行了ELISA试验，验证了核糖开关在AAV载体的背景下可以调节hEPO的表达（图5）。考虑到口服给药后ASP7967在小鼠肝脏中浓度较高，作者选择了肝脏作为靶组织，并选择了靶向肝脏的AAV8作为载体。通过在多个时间点抽取血液并测定血清中的hEPO含量，作者发现给药后6-8小时，hEPO的分泌水平达到了115 mIU mL−1，相比阴性对照组增加了7.2倍（图6）。

图6. AAV在小鼠体内的实验结果。

为了验证核糖开关在体内的效力和功能，作者根据一项基于外显子跳跃的专利设计了一种核糖开关，该开关可以通过适体-小分子相互作用诱导外显子跳跃（图7）。在这个设计中，适体被放置在第二个内含子5'剪接位点的下游。当没有小分子存在时，自杀外显子会被包括在转录本中，导致基因表达处于OFF状态。而当存在小分子时，适体-小分子相互作用会导致5'剪接位点被掩盖，从而产生外显子跳跃现象，使得基因表达处于ON状态。经过优化，该系统的ON/OFF比最高可达到114。然而，为了进一步提高系统在ON状态下的表达水平，作者将之前提到的CPP系统插入到3' UTR区域，并经过优化，成功提升了系统在ON状态下的表达水平，并且实现了更高的ON/OFF比，分别达到了177和296。

图7.外显子跳跃模型（A）及实验结果（B）和CPP与外显子跳跃联用模型及结果（C）。

结论：

（1）作者成功筛选出ASP2905及其衍生物ASP7967的RNA适体AC17-4，并进行了突变分析，为进一步优化提供了策略。

（2）通过CPP系统验证了基于AC17-4的核糖开关可以在哺乳动物细胞中调控基因表达，且在存在5 μM小分子的条件下，可以实现10倍的表达放大。

 （3）通过CPP系统与CPP和外显子跳跃联合系统的验证，证明了基于AC17-4的核糖开关可以在哺乳动物体内调节基因表达，后者在ON状态下不仅具有较高的表达水平，还具有较高的放大倍数。