ANGEW丨功能化适体 DNA 电路可在 T 细胞和癌细胞之间建立人工相互作用
近日,湖南大学谭蔚泓院士团队在Angewandte Chemie上发表题为“An Aptamer-Functionalized DNA Circuit to Establish an Artificial Interaction between T Cells and Cancer Cells”的研究论文。该研究开发了一个适配体功能化的DNA电路来调节T细胞和癌细胞之间的相互作用。
嵌合抗原受体(CAR) T细胞在实验室中通过基因工程来表达重组跨膜蛋白,是操纵细胞间反应模式的典型例子。因此通过整合抗原识别和T细胞激活到一个信号通路,CAR - T细胞可以直接结合并杀死癌细胞。然而CAR-T疗法的实验室工程复杂、耗时且可能有风险,这对免疫治疗构成了挑战。因此作者设计了另一种方法,目的是通过控制固有受体的功能行为来操纵细胞间反应网络。为了实现这一目标,他们使用到DNA电路,它能在分子水平上实现可编程逻辑操作,在生物调控方面显示出很大的潜力,被用来操纵细胞间反应网络,包括信号的感知、处理和传输。
该DNA电路由识别-触发和聚集-激活两个模块组成。为了检测癌相关抗原的存在,选择了在3’端具有不同延伸序列的适配体Sgc8c (ASn,“n”表示整个探针的序列长度)作为识别配体,它特异性地与蛋白酪氨酸激酶7 (protein tyrosine kinase 7, PTK7)结合,PTK7受体在许多癌细胞膜上高表达的。为了诱导癌症特异性T细胞刺激,一个与ASn部分互补的DNA链被设计为触发元素,称为Tr,最初通过形成稳定的ASn-Tr双链结构被阻断。为了控制T细胞的活性,CD28,一种能够在T细胞激活时产生共刺激信号的免疫受体。CD28受体的聚集可促进T细胞活化,信号转导幅度增加,这是许多其他免疫受体的共识,如CD3和T细胞受体(T cell receptor, TCR)在受体操作方面,利用延伸片段合成了一种cd28特异性2’-氟修饰RNA适配体,用于通过DNA杂交将两个DNA单体H1和H2结合(合成的探针分别命名为Apt - H1和Apt - H2)。ASn与PTK7阳性癌细胞特异性结合后,会发生构象转换,释放Tr,释放Tr后触发Apt-H1和Apt-H2之间的杂交链反应(HCR),诱导CD28受体聚集,从而促进T细胞活化,提高肿瘤杀伤能力。作为概念验证了这种适配体功能化的DNA电路在癌症导向的T细胞刺激和基于T细胞的癌症特异性杀伤方面的潜力,为免疫治疗提供了一种新的系统。
工作原理示意图
体外识别和引发模块的验证。
为了构建癌症识别-触发模块,一个关键的考虑因素是ASn Tr 双链的异构性,它应该足够稳定以减少Tr的非特异性泄漏,但在识别到目标癌细胞时仍能迅速解离,释放出 Tr 以启动 Apt-H1 和 Apt-H2 之间的 HCR。为了建立荧光以指示细胞结合事件,ASn 和 Tr 的 3'- 端分别用FAM和 Cy5荧光团标记。CEM 是一种高表达 PTK7 的急性淋巴细胞白血病细胞系,被用作靶癌细胞模型。用流式细胞仪检测发现,AS52Tr 处理的 CEM 细胞的 FAM 荧光轮廓发生了显著的变化(图1A),而用 AS53Tr 或 AS54Tr 处理的 CEM 检测到的 FAM 信号要低得多,这表明 AS52 Tr 保持了更好的细胞靶向能力。为了触发 T 细胞表面的 CD28 聚集,设计了由H1/ H2 单体的 Tr 引发的 HCR。用原子力显微镜(AFM)观察,HCR 产物呈现长纳米线形态,而在不添加 Tr 的 H1 和 H2 混合物中只观察到高度约为 2 纳米的微小斑点(图 1C)。PAGE 分析也证实了 Tr 诱导的H1和H2 之间的串联杂交。通过将 H1/H2 混合物与单个 ASnTr 双链体在 37 °C 下培养 15 小时,评估了 HCR 的潜在非特异性泄漏。为了在靶细胞结合能力和非特异性泄漏之间取得平衡,我们选择 AS52Tr 作为所有后续研究的最佳设计。此外,还评估了所有寡核苷酸成分(AS52 Tr、Apt、H1、H2 和 Tr)的生物稳定性。
体内验证聚集和激活模块。
继续测试聚合然后激活模块在调节T细胞活性方面的性能。为了表征HCR在T细胞表面的发生,分别用Cy5和Cy3荧光团标记了Apt-H1和Apt-H2。如图2A所示,加入Tr后,在Apt-H1/Apt-H2预结合T细胞上,Cy5和Cy3的Förster共振能量转移比值显著增强,表明HCR诱导CD28受体在细胞表面聚集。CD28受体的聚集可以通过TCR/CD3复合物的连接提供一个关键的次级信号,促进T细胞的激活(图2B)。首先通过使用CFSE稀释的细胞增殖试验验证了该DNA回路调节T细胞活性的可行性。CFSE预染色的小鼠T细胞以CD3抗体为主要信号刺激,经Apt-H1/Apt-H2混合液处理,再加入不同浓度的Tr。37°C孵育72 h后,用流式细胞仪分析细胞。如图2C和2D所示,当Tr浓度从1.25 nM增加到62.5 nM时,T细胞的增殖逐渐增强。特别是在62.5nM Tr的作用下,细胞增殖率达到70%,其中12%分化至第四代。采用酶ELISA检测T细胞活化的另一标记物——白细胞介素2的分泌。如图2E所示,添加Tr后,经Apt-H1/Apt-H2预处理的细胞IL - 2分泌量增加,还可以诱导功能化T细胞表达更高数量的CD69(图2F)。基于这些结果,tr触发的HCR诱导CD28受体聚集,而不是单独结合Apt-H1/Apt-H2,促进了T细胞的活化。
模块在体内的整体验证。
展示了模块的性能后,接下来将它们集成为一个完整的电路,并评估其调节癌细胞和T细胞之间相互作用的潜力。为了验证这一DNA通路对癌症促进T细胞激活的可行性,将经过Apt-H1/Apt-H2预处理的T细胞与CEM细胞在不同条件下孵育。如图3A所示,加入AS52-Tr后,T细胞增殖指数明显增强,而用Lib52-Tr替代AS52-Tr后,增殖指数降低。同样,只有AS52-Tr与靶向CEM细胞共存时,才能促进CD69的表达(图3B)和IL2的产生(图3C)。这些结果表明,适体功能化DNA回路可以增强靶向癌细胞对T细胞的刺激。
然后测试了这种DNA回路在促进T细胞为基础的癌症杀伤方面的性能(图3D)。与未转染细胞的微弱荧光相比,转染细胞经Cy5标记的Sgc8c处理后,可以观察到较强的Cy5荧光与EGFP荧光呈正相关,证明PTK7在细胞膜上成功表达。同时,取OT-I小鼠的CD8+ T细胞,功能化的OT-I T细胞与ptk7阳性的靶癌细胞在AS52-Tr存在下孵育后,T细胞增殖显著增加,同样,通过与ptk7阳性癌细胞和AS52-Tr共同刺激功能化的OT-I T细胞,可以实现更高水平的IL-2分泌(图3E),这表明该DNA回路能够促进目标癌细胞促进的T细胞激活。然后通过将ptk7阳性的靶癌细胞与功能化的OT-I T细胞在不同条件下孵育24小时来研究当前体系的抗癌效果。图3F、G显示添加AS52-Tr后靶癌细胞的还原率为2.6倍。
活体抗癌肿瘤效率。
为了探索这种适体功能化DNA电路在体内的应用潜力,将PTK7阳性的B16F10-OVA植入小鼠皮下。接种肿瘤3天后,将小鼠随机分为3组按图4A进行试验。III组的肿瘤抑制率达到64.2%。II组的肿瘤生长速率与对照组i相似。这些结果证明了适配体功能化DNA回路在促进T细胞抗肿瘤治疗方面的潜力。在第11天处死小鼠后,分析肿瘤组织中T细胞的含量。流式细胞术CD3+信号显示,III组的T细胞数量分别是I组和II组的22倍和12倍(图4F),III组CD8+ T细胞的百分比达到70.10%(图4G)。
综上所述,该实验证明了T细胞的活性可以通过基于aptamer的目标癌细胞识别和随后释放的触发链诱导CD28受体的聚集来促进。作为一种正反馈,受刺激的T细胞可以在体内和体外诱导增强对目标癌细胞的杀伤。通过重新设计DNA回路,靶向CD3、TCR等主要信号受体,有望进一步提高免疫效果。结合DNA的高可编程性和适体技术的快速发展,该DNA电路可以扩展到操纵其他细胞表面受体,从而为调节细胞相互作用网络以及开发基于细胞的治疗提供了新的范式。