Cell Discov.丨RD4 靶向 PROTAC 作为研究生物分子凝聚物的独特工具

大家好，今天给大家分享一篇2023年发表在Cell Discovery上的“RD4-targeting PROTAC as a unique tool to study biomolecular condensates”。通讯作者分别是清华大学药学院饶燏教授、清华大学医学院李海涛教授和清华大学生命学院李丕龙教授。饶燏教授的主要包括发展小分子靶向蛋白降解技术；依据蛋白质三维结构进行抗肿瘤、抗感染疾病小分子化合物的设计、合成与开发。李海涛教授长期从事表观遗传修饰识别与调控研究，扩充表观调控因子在遗传信息解读，以及癌症、白血病等人类疾病中的发生作用机制。李丕龙教授的主要研究方向包括相分离现象的普适化调控机制与规律；相分离在自噬、转录调控、表观遗传等领域的生物学意义。

1. 研究背景

液液相分离 (liquid-liquid phase separation, LLPS)是生物大分子在真核细胞中聚集形成无膜细胞器的基础，也是细胞区域化的重要机制。当前，如何建立相分离现象和生物学功能之间的关系是该领域内的重要科学问题。相分离对系统计量高度依赖，因此需要高效、快速、动态的扰动技术的支持。1,6-乙二醇是常用的相分离破坏试剂，其被认为会破坏疏水相互作用从而破坏LLPS。然而，1,6-乙二醇的破坏作用是非特异性的，可导致细胞内生物分子凝聚体的广泛损伤。此外，现有技术手段如CRISPR-Cas9及RNA interference等遗传学工具在体内直接研究相分离面临很多挑战。基因编辑技术对DNA修改具有不可逆的特点，难以获得编码蛋白质的中间状态。RNAi技术由于起效时间长，难以检测在体内快速动态的相变化过程。小分子抑制剂虽然能够影响相分离的形成，但其多作用于底物结合位点，而相分离常由其他骨架功能蛋白质诱导，会导致研究不够充分。

综上，目前相分离领域仍然缺乏直接干扰LLPS的高效方法。如何快速、可逆地监管LLPS，如何研究LLPS中关键蛋白的相互作用机制仍然是关键问题。

表1 传统LLPS研究方法

PROTAC (Proteolysis-Targeting Chimeras)技术是近年来蓬勃发展的新兴蛋白质降解策略。PROTAC的基本原理是使用双功能小分子，通过泛素-蛋白酶体系统，诱导靶蛋白的泛素化，进而实现靶蛋白降解。

该研究中，作者利用PROTAC高效、快速、可逆、动态降解靶蛋白的特性，通过降解表观遗传调节因子-BRD4探究其形成相关生物大分子凝聚物特征，这是PROTAC在LLPS研究中的首次运用，为解决领域内关键问题提供了新方法和新见解。

2. 研究结果

结果1 “PROTAC-靶蛋白-LLPS”方法的建立

为了验证PROTAC对目标蛋白凝聚物的影响，研究人员选择BRD4蛋白作为靶蛋白。BRD4有两个主要转录本，长(BRD4 l)和短(BRD4 s)异构体，属于BET家族，其家族成员包括BRD2，BRD3，BRD4和睾丸特异性BRDT，被广泛认为是生物学中的主要转录调节因子。此外，研究人员使用了一个候选的PROTAC分子，命名为ZXH-3-26（图1 a）。首先，研究人员发现BRD4以剂量依赖的方式选择性地降解内源性BRD4长、短异构体。随后，研究人员通过western blot分析和免疫荧光检测评估了不同PROTAC降解剂浓度和不同处理时间下HeLa细胞的蛋白质降解情况。在一定范围，BRD4的降解与ZXH-3-26浓度呈线性相关。但超过一定浓度后，降解效率下降（图1 b-d）。接下来，研究人员对不同时间点的HeLa细胞进行ZXH-3-26处理，观察到处理30min时BRD4降解明显并且随着时间增加被完全耗尽（图1 g）。综上所述，研究结果表明PROTACs可以作为一种合适的工具来干扰细胞内BRD4凝聚物。

图1. “PROTAC-target protein-LLPS”研究方法的建立

结果2  ZXH-3-26对BRD4凝集物的动态扰动

由于ZXH-3-26诱导BRD4降解是快速且可逆的，研究者希望利用这个工具来探索相分离的动力学和分子机制。为此，他们构建了稳定表达EGFP-BRD4的HeLa细胞系。对表达EGFP-BRD4的HeLa细胞进行延时成像，监测ZXH-3-26处理后BRD4凝聚物的变化过程（图2 a）。结果显示，在ZXH-3-26处理后的2 h内，细胞核内BRD4凝聚体的数量逐渐减少，荧光信号也逐渐减弱（图2 b）。为了评价PROTACs蛋白降解的可逆性对LLPS的影响，他们进行了PROTACs的冲洗实验。令人惊讶的是，在完成冲洗实验后，BRD4凝聚物在18 h内迅速完全恢复（图2 d-e）。然而，western blot分析表明，BRD4在18 h后仅部分恢复（图2 c）。即BRD4相关凝聚物的恢复可能优先于BRD4蛋白水平的恢复，这是PROTAC应用于LLPS研究首次发现的现象。

图2. BRD4-PROTACs的可逆性研究

结果3  ZXH-3-26对相分离生物效应的调控

为了进一步阐明BRD4凝聚物在蛋白质水平恢复上的优先性，研究人员使用了全基因组染色质结构测量和RNA转录组测序（图3 a-c）。基因表达分析表明，随着冲洗时间的增加，不同的基因与DMSO组显著降低，并且洗脱实验后的上调基因主要与RNA聚合酶转录调控相关。同时，CUT&Tag-seq结果表明随着降解剂的去除，BRD4在短时间内迅速恢复并更偏好占据在super-enhance区，尤其是一些关键癌基因和细胞周期基因的super-enhance区（图3 d-e）。这是第一次用ZXH-3-26观察到生物大分子凝聚物转录调控的变化。总的来说，CUT&Tagseq进一步证实了在PROTACs治疗BRD4蛋白过程中，BRD4凝聚物在短时间内恢复，优先占据super-enhancer区，进一步发挥功能。

图3. BRD4-PROTAC降解及Wash-out实验

结果4  ZXH -3-26诱导的BRD4降解影响了凝聚物中其他组分的变化

生物大分子凝聚物中各组分的多价态相互作用是LLPS的基础，剖析其中关键组分蛋白之间的物理及功能交互是LLPS领域内的关键问题。在这里，研究者首先展示了BRD4相关蛋白的相互作用网络（图4 a）。基于BRD4-PROTACs，进一步探讨BRD4相关凝聚物中其他重要组分（MED1/CYCT1/p300）的相变化。探讨BRD4扰动是否是super-enhancer复合物的关键因素，并观察其对SE复合物中其他组分的影响(图4 b)。研究者发现，ZXH-3-26处理6 h后，CYCT1和MED1的凝聚物也随着BRD4凝聚物的减少而平行减少。然而，随着PROTACs处理时间的延长(12 h和24 h)， CYCT1和MED1的凝聚物逐渐恢复。同时，作为BRD4的上游分子、p300在其凝聚物中没有明显的扰动，说明p300凝聚物中的BRD4可能不是关键蛋白。这是首次使用PROTACs观察到BRD4是否是super-enhancer中其他组分凝聚物中的关键组分。研究者推断ZXH-3-26在短时间内破坏了super-enhancer区的BRD4 - CYCT1-MED1凝聚物。但随着时间的推移，细胞启动代偿作用，在没有BRD4的情况下形成新的凝聚物，促进功能作用。

图4. 利用ZXH-3-26探讨BRD4是否是凝集物的关键驱动因素

为了进一步证实这一假设，研究者在ZXH-3-26处理下进行了多组学分析。首先，研究者对ZXH-3-26和JQ1处理6 h和12 h的HeLa细胞进行了RNA测序（图5 a）。结果表明，ZXH-3-26针对BRD4进行降解的效果要强得多。为了研究BRD4降解对super-enhancer区凝聚物组分的短期扰动，研究者进一步将HeLa细胞中的BRD4和MED1进行CUT&Tag-seq。研究者发现，ZXH-3-26处理6 h和12 h后，与JQ1相比，BRD4在TSS和super-enhancer区域的结合明显减少。对于MED1，ZXH-3-26处理后12h时启动子区域比处理后6 h时有所增加。相反，super-enhancer区域没有显著差异(图6 b-d)。这可能解释了为什么MED1凝聚物在12 h时恢复到与DMSO组相似的水平。研究者认为可能是由于BRD4缺失后，其他BET家族成员的代偿作用。

图5. BRD4降解剂和BET抑制剂对BRD4、MED1结合位点富集的影响

3. 总结

总之，在该工作中，研究者首次建立了“PROTAC-target protein-LLPS”的研究方法，利用PROTAC高效、快速、可逆、动态降解靶蛋白的特性，以BRD4为目标蛋白，通过降解BRD4探究其相关生物大分子凝聚物形成特征，以期从多维度探究LLPS相关的内源蛋白-蛋白相互作用、蛋白时空动态调控的精密机制。另外，将此方法与多组学联合分析，不仅能够探究凝聚物中各组分之间的互作和功能伴随，而且将为相分离与生物功能之间建立因果关系提供可能。

图6. BRD4-PROTACs工作模型示意图

原文链接：

Shi, Y., Liao, Y., Liu, Q. et al. BRD4-targeting PROTAC as a unique tool to study biomolecular condensates. Cell Discov 9, 47 (2023). https://doi.org/10.1038/s41421-023-00544-0