PNAS丨通过耦合 Taq DNA 聚合酶和分子信标报告基因的 50-flap 核酸内切酶活性进行高度多重 PCR 测定

大家好，本次跟大家分享的文献是2022年厦门大学研究团队发表在PNAS上面的Highly multiplex PCR assays by coupling the 50 -flap endonuclease activity of Taq DNA polymerase and molecular beacon reporters。这项工作提出了一种被称为“MeltArray”的检测技术。这是一种高度多重的PCR方法，它通过结合Taq DNA聚合酶的5’端内切酶活性和分子信标报告基因的多个退火位点来实现在目前的实时PCR检测中识别出10倍多的靶点，且不需要额外的酶或单独的反应，实现了72重的重大突破，填补了长期存在于低阶PCR和NGS检测二者之间的技术空白。

一、作者介绍：

本篇文章的通讯作者是厦门大学李庆阁教授，他长期从事基因定量、变异分析和纳米标记检验医学领域关键技术的研究。已取得如下成果 1）揭示寡核苷酸一种新的杂交反应模式，发明置换探针和置换引物；2）提出多色探针组合编码技术，拓展了实时PCR的检测能力；3）发现了新型的可用于多色探针熔解曲线分析的双标记自淬灭探针，将突变分析从传统的低通量水平提升到中通量水平；4）提出二维标记技术，将核酸“熔点”这一物理性质转化为一种探针标记物，与荧光标记物相结合，发展出了通用的多重核酸分析技术，使均相检测模式的通量达到传统异相检测模式的水平。

二、背景：

荧光定量PCR是目前应用最广泛的核酸检测技术之一，但荧光定量PCR分析的限制是它在单管反应中同时检测各种不同目标的能力低，这是因为荧光定量PCR仪器的中区分各种不同荧光颜色的能力有限，通常只有4-6个通道。这极大限制多重复杂检测的能力。大多数已建立的qPCR扩增检测技术都涉及单个靶标的特异性荧光探针。当分析许多不同的靶标时，这些探针的合成会增加分析开发过程中的总成本。如果使用通用和特异性的引物结合进行扩增，有可能造成非特异性产物。因此，在使用保证特异性的基础上，使用中介探针可以解决这个问题。

中介探针包括一个靶标特异性的探针部分和一个通用的中介引物部分，探针的3’末端需要进行封闭。在上下游引物参与延伸的前提下，探针结合靶标后，中介探针被聚合酶的5’端核酸酶活性裂解。中介探针的断裂会释放中介引物，该引物继而启动通用的报告系统。通用报告系统包含两部分，分子信标部分和与中介引物结合的区域。中介引物会与通用报告系统中的中介引物结合区域发生互补后进行延伸。延伸后可以通过对分子信标的剪切完成淬灭基团和报告系统的分离，或者通过占据茎部的区域，将原本分子信标中淬灭基团的茎部替换下来，使荧光和淬灭基团彼此相互远离，两种办法都可以让荧光得到释放，荧光会在每个PCR循环中得到积累。

三、研究结果：

多重扩增探针熔解曲线法（(Multicolor Melting Curve Analysis；MMCA)可以在单个荧光通道下同时对多个靶标进行检测，通过熔解曲线Tm值的不同来判定是哪个靶标发生了扩增。基于探针法和熔解曲线分析法，结合多色荧光检测，可同时检测一个反应中的多个靶标。传统的MMCA检测中，报告探针系统分为直链型的Taqman探针和分子信标两种形式。因此作者团队对中介探针使用的报告系统也需要对这两种报告系统进行初步筛选。线性探针产生了两个熔化峰（图1A)，分子信标产生了一个熔化峰（图1B)。两种报告系统都能获得正常的扩增曲线和目标溶解曲线峰，但直链Taqman探针型报告系统在主峰的左侧产生了一个杂峰，这是因为分子信标不能与中介探针形成荧光杂化，而线性探针可以形成荧光杂化，产生一个较低的Tm峰值。探究结果显示分子信标型报告系统降低了背景，它具有更高的特异性，更适合多重荧光定量检测。

图1 两种双标记、自猝灭探针作为5’ -FEN PCR检测的报告基因时的比较

1、MeltArray技术

这篇文章的作者们提出了一种被称为“MeltArray”的检测技术，该技术融合了MMCA和中介探针的方法，且使用的报告系统不再是茎环+末端悬挂序列的结构，因为这种结构的茎环型分子信标部分会被切割，进而导致熔解曲线峰降低，不利于熔解曲线法检测。因此，该技术的报告系统采用了传统的分子信标结构，但是它的环部序列设计成了较长的一段序列，这样就可以同时容纳多个中介引物与其结合。中介引物结合环部后进行延伸，通过形成双链的刚性结构打开茎环。延伸出的单链和茎环后续可以进行溶解曲线分析。不同的中介引物由于结合部分不同，延伸出来得到的单链长度不同，和报告系统进行溶解曲线分析，在56-91℃的宽范围内有间隔的产生了不同的Tm值，Tm的差值在3℃左右。这样就可以获得一组12个可区分的Tm值。

MeltArray检测包括12个不同的中介探针，这12个中介探针都包含一个独特的中介引物序列，该序列与分子信标报告基因环中不同的预定义区域互补。因此，当这12个不同序列的中介引物结合到分子信标报告物的环上被酶延伸后，每个不同的中介引物将产生一个部分双链报告物，其双链部分的长度将不同。经过最终的熔融分析，结合测量的Tm和荧光团的颜色，可以识别出12个不同的目标序列。中间部分为多条中介引物和分子信标的结合延伸产生不同Tm值（图2A）。在多重PCR扩增上，MeltArray也有其特殊的设计，首先在每个目标特异性引物的5’端添加一个与任何目标序列都不互补的20个核苷酸长的“标签序列”，经过前几轮扩增，得到的扩增子在其5’端具有完整的引物序列（包括标签序列），在3’端有该引物对其他成员的整个补体（包括标签序列的补体）。在检测混合物中还存在一个高浓度的单一“通用引物”，其序列与标签序列相同。因此，这些丰富的通用引物与扩增子3’端的互补序列杂交，有效地启动了样本中所有目标序列产生的所有扩增子的指数合成。之后标签对应的通用引物（大量）完成后续的PCR扩增过程，这样做的好处是保证不同的扩增产物的量比较均衡，从而让多个靶标都被检测到而没有遗漏。

另外为了靶标能有效率的被扩增，引物二聚体等二级结构也需要被消除掉，这里使用了一种被称为“Hands”的方法，还是刚刚提到的5’标签，这里上下游使用的标签是相同的，因此上下游引物延伸出的两条单链，如果扩增产物的长度不长，会自发形成以标签为茎部的茎环序列，茎环序列的Tm值高于引物二聚体的Tm值。在引物的5’端添加一段通用引物，使多重PCR扩增变为单重PCR扩增，降低了多个引物之间的干扰。既不影响高温变性打开后作为模板参与下一轮延伸，又可以阻止引物非特异性的形成二聚体。引物即使和茎环的茎部能发生互补，其延伸也会受到抑制。

通过扩增和检测技术的优化，MeltArray可以实现远超4-6重的检测能力。之前提到报告系统可以允许多个中介引物的结合，经过优化后单个荧光通道理论上可以达到12个靶标。结合宏石SLAN96S上的六个荧光通道Atto 425 (450 nm)、FAM、HEX (565 nm)、ROX、Cy5和 Quasar 705 (705 nm)。最终可以同时在单管中完成72个靶标的同时检测，这无疑是重大的突破，实现了荧光定量PCR向阵列式的转变。

图2裂解比例取决于CpG的甲基化状态

2、MeltArray 应用于SRY不孕检测

  为了探索MeltArray在多重PCR检测中的潜力，他们测试了使用不同颜色荧光团标记的多分子信标报告基因进行20倍PCR检测的可行性。这个试验用于检测18染色体特异性序列标记在不同的无精子症因子区域（AZFA，AZFb，AZFc，AZFd）的人类Y染色体，除了检测SRY基因作为阳性控制的Y染色体DNA和ZFX/Y基因作为阳性控制的X和Y染色体DNA（图3）。这些靶点分别用FAM、ROX和Cy5标记的三对分子信标报告基因进行鉴定，每对报告基因用相同的荧光团标记（图3B）。这种20倍的检测方法在一个拥有所有目标序列的健康男性中产生了20个峰。然而，在一个不育的男性中，一个或多个这些峰值可能会缺失。优化后，使用黑素阵列法分析了83个来自健康男性的基因组DNA样本。健康男性的20个目标区域都被正确检测到（图3C）。通过比较MeltArray检测结果与常规使用的凝胶电阻PCR检测的结果，证实了MeltArray检测结果的准确性。并且从100 ng到 100 pg的基因组模板量都能被成功检测到，随着模板量的降低，溶解曲线峰的高度也降低，但是其Tm值不变。

图3MeltArray检测人类Y染色体中的微缺失

3、MeltArray 应用于大肠杆菌血清型检测

    20重PCR应用已经得到验证，接着他们开始设计验证更多重的检测。他们使用六个荧光通道设计了一个62重PCR的MeltArray检测体系，用于识别61种O抗原合成基因及1个大肠杆菌管家基因yccT。对于每个不同颜色的荧光团，他们使用了8到12个不同的中介探针，每个探针释放一个不同序列的中介引物，如果其相应的目标序列被扩增，就会得到一个预定义的Tm。该MeltArray检测能够产生62种不同的荧光团组合，用于鉴定61个O基因型和1个E.共特异性基因yccT（图4A）。重复性研究表明，所得到的Tm值波动很小，从而使每个潜在的目标能够被明确地区分（图4B）。

他们采用MeltArray方法筛选了167株大肠杆菌，其中包括150株具有33种不同的O血清型（通过常规血清分型确定）和17株通过常规血清分型未能给出表型结果的分离株。在150株具有已知血清型的分离株中，有一株与常规血清分型相比，得到的黑体阵列结果不一致。这一株分离物的MeltArray结果随后通过全基因组测序（WGS）证实他们检测到的分型结果是正确的，即他们的方法纠正了血清型检测中的一株错误(图4C)。在未能给出常规血清分型结果的 17 株分离株中，MeltArray 成功鉴定出 11 株表现出 7 种不同 O 基因型的分离株。这些结果在之后的验证工作中得到了证实。其余六个分离株没有发出信号。然而，这六种分离株中的四种被发现具有MeltArray所涵盖的基因型之外的基因型测定。其他两个分离株甚至没有被WGS鉴定出来。这些结果表明，MeltArray 靶检测技术在血清检测方面比传统血清分型更可靠。此外，MeltArra分析产生的结果与WGS的结果相当。

图4 MeltArray方法对大肠杆菌61种O基因型的鉴定

4、MeltArray应用于呼吸病原体定量检测

作为一种终点熔融分析，那么就会存在一个问题就是MeltArray分析是否也可以进行实时PCR检测。他们选择呼吸道病原体作为模型目标，因为一些病原体更能提供定量结果，而其他一些病原体只需要提供定性鉴定。他们设计了一种24倍的呼吸检测方法，可以检测14种不同的RNA病毒种类，两种不同的DNA病毒种类，三种不同的非典型细菌种类，四种不同的典型细菌种类，以及一种人类控制基因（RNase P）。在这些目标中，重要的是要定量的四种典型细菌种类的数量，以区分感染和定植的样本。

接下来他们就同时采用实时荧光定量PCR和熔融曲线分析对呼吸道病原体的鉴定和定量，他们进行了24重荧光定量PCR检测的结果，将19种非定植菌/病毒和1个内控基因设置为熔解分析模式，即定性检测；另外4种靶标设置为实时PCR检测模式——即TaqMan探针模式，即定量检测。常规的分子信标的荧光增量是由于分子信标和靶标结合后打开茎环使得荧光得到释放，而对于四种定量检测的分子信标，在设计时将环部分和茎的3’端部分设计成可以和靶标结合的形式，这样能保证分子信标被Taq酶剪切而不只是被引物进行替换，这样就产生了积累荧光。这些实时荧光强度测量是在每个热循环的95°C变性阶段收集的，在此温度下，所有未裂解的分子信标探针和所有分子信标记者都以短单链随机线圈的形式存在，其荧光团和猝灭剂通过荧光共振能量转移相互作用，形成一个相对低强度的背景信号（图5A）。该体系在定性检测19种靶标的同时，成功实现了4种靶标的定量检测。24重PCR的MeltArray检测体系分析灵敏度达10 copies/μL。通过对67份肺炎或呼吸道感染患者的肺泡灌洗液样本的验证，证实了检测结果的可靠性。因此，这些实验结果证实MeltArray同时实现了实时荧光定量PCR检测和MeltArray分析（图5B）

图5同时采用实时荧光定量PCR和熔融曲线分析对呼吸道病原体的鉴定和定量

5、MeltArray 应用于KRAS基因的SNP检测

之后他们探讨了MeltArray分析是否可以用于在单核苷酸水平上区分序列变异，从而能够识别与为癌症患者选择合适的治疗药物相关的某些突变的基因型。他们根据KRAS 12号和13号外显子上的10个SNP位点设计了十个中介探针，分为四个荧光通道，每个探针都针对不同的目标序列（匹配和不匹配目标之间的Tm差异>7°C），每个探针都设计释放一个独特的中介引物，与四种不同颜色的发夹报告基因中的一个相互作用（图6A）。结果表明，该方法对每种突变型都产生了可区分的信号，并且可以耐受大量的野生型基因组DNA（高达500 ng）。检测到的最低突变等位基因频率（MAF）为5~10%（图6B），优于传统Sanger测序的敏感性，最低MAF为20%。计算的LOD为30个目标序列拷贝/反应。

接下来他们使用该方法分析了167 个不同的组织样本，包括107个新鲜冷冻的样本和60个福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本，MeltArray检测比Sanger 测序多检测到三个突变样本，在60个FFPE样本中，MeltArray检测比Sanger测序检测到的突变样本多两个。这些结果表明，对于检测低MAF突变，MeltArray 检测比Sanger测序检测更敏感。   

图6. MeltArray分析中KRAS突变的微测序

• 总结

MeltArray四个具体案例，涵盖了IVD检测的主流项目，即遗传病检测，传染病检测和肿瘤检测，体现了MeltArray作为成熟核酸检测的典型特征。MeltArray融合了MMCA、中介探针、通用引物和“Hands”等实验方法，在检测中灵活的使用了对3’端与靶标结合的分子信标方法，这种组合运用最终形成了精妙的检测方法。但是MeltArray检测方法具有需要进一步改进的局限性。首先，作为一种终点检测模式，尽管熔解曲线的峰高与一定范围内的目标量成正比，但其定量能力受到限制。因此，MeltArray主要用于筛选分析，而不是定量检测。这种局限性还需要进一步研究及改进。总的来说这种高度多重的PCR方法，它可以在目前的实时PCR检测中识别出10倍多的靶点，而不需要额外的酶或单独的反应。它实现了72重的重大突破，填补了长期存在于低阶PCR和NGS检测二者之间的一个技术空白。